Beurteilung der funktionellen Wiederherstellung der Eupneik-Zwerchfellaktivität nach einseitiger Hemisektion des zervikalen Rückenmarks bei Ratten

In den Vereinigten Staaten gibt es mehr als 300.000 Menschen mit Rückenmarksverletzungen, von denen etwa die Hälfte Gebärmutterhalsverletzungen hat¹. Diese Verletzungen führen zu einem erheblichen Verlust des Wohlbefindens und stellen eine finanzielle Belastung für den Einzelnen, seine Familien und das Gesundheitssystem dar. Glücklicherweise ist die Mehrheit der Querschnittlähmungen unvollständig – was das Potenzial zur Stärkung verschonter Signalwege bietet¹. Diese Neuroplastizität kann die Wiederherstellung zumindest einiger Funktionen ermöglichen, einschließlich der DIAm-Aktivität, die für beatmungstechnisches und nicht-beatmungsbezogenes Verhalten wichtig ist. Daher ist die Förderung der Neuroplastizität ein vielversprechender Forschungsweg, um Menschen mit Rückenmarksverletzung² zu helfen.

Nagetiermodelle für Querschnittlähmung haben das Potenzial, einen wesentlichen Beitrag zur Entdeckung von Behandlungen zur Verbesserung der menschlichen Gesundheit zu leisten. Eines der klassischen Modelle der Querschnittlähmung, das zur Untersuchung der Neuroplastizität verwendet wird, ist eine einseitige Durchtrennung (Hemisektion) des Rückenmarks bei C₂ (C₂SH), bei der die kontralaterale Seite intakt bleibt 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. Die Wirkung von C₂SH auf die phrenische Ausscheidung und die Bedeutung verschonter kontralateraler Wege wurde erstmals vor über hundert Jahren von Porter¹² aufgedeckt, dessen bahnbrechender Artikel den Grundstein für moderne Studien zur respiratorischen Neuroplastizität legte. Das C₂SH-Modell unterbricht absteigende Inputs aus der rostralen ventralen Atmungsgruppe (rVRG) in der Medulla, die prämotorische Neuronen enthält, die für die Übertragung der Ausgabe der Atmungsrhythmusgeneration verantwortlich sind¹⁴. Diese rVRG-Prämotorneurone übertragen auch exzitatorischen neuronalen Antrieb an phrenische Motoneuronen (Abbildung 1). Mehrere Forscher haben unterschiedliche Ansätze für das C₂SH-Modell^gewählt 10,11,15,16, was teilweise einen Teil der Variabilität in der Genesung zwischen den Studien erklären könnte. Kurz gesagt, die Ansätze variieren in Bezug auf die Schonung der dorsalen Funikuli, die Durchführung einer vollständigen Hemisektion oder die Durchführung einer lateralen Teildurchtrennung, die die absteigenden Eingaben aus dem ipsilateralen rVRG nicht vollständig unterbricht. Im Allgemeinen sind C₂SH-Modelle besonders nützlich für die Untersuchung der respiratorischen Neuroplastizität aufgrund der Raten der spontanen Erholung der elektromyographischen (EMG) eupneischen iDIAm-Aktivität im Laufe der Zeit, die durch mehrere Faktoren, einschließlich der neurotrophen Signalgebung, verbessert werden kann 17,18,19,20,21. Ein anfänglicher Funktionsverlust – definiert als die Stilllegung der eupneischen iDIAm-EMG-Aktivität – muss jedoch zunächst festgestellt werden, bevor eine Wiederherstellung eindeutig klassifiziert werden kann. Diese Validierung der Inaktivität zum Zeitpunkt von C₂SH wurde in mehreren Studien^{nicht durchgeführt} 3,4,6,7,11,22,23.

Histologische Untersuchungen des exzidierten Rückenmarks liefern nur Hinweise auf eine Schädigung der geeigneten Lokalisation der ipsilateralen exzitatorischen bulbospinalen Bahnen, die phrenische Motoneuronen im Rückenmark innervieren, aber die Histologie ersetzt keine physiologische Evidenz (z. B. DIAm EMG). Darüber hinaus werden histologische Untersuchungen ex vivo zu Endzeitpunkten (oft mehrere Wochen bis Monate nach der Verletzung) durchgeführt und liefern daher keine “Echtzeit”-Informationen. Einige Forscher haben festgestellt, dass das Ausmaß der Läsion mit dem Ausmaß des funktionellen Defizits oder dessen Fehlen zusammenhängt 5,24,25,26. Es ist wichtig zu beachten, dass die Gültigkeit solcher Behauptungen wahrscheinlich stark davon abhängt, wie “Funktion” klassifiziert wird (d.h. was die funktionellen Aufgaben sind und wie sie quantifiziert werden), und die Variabilität zwischen den Studien unterstreicht die Schwierigkeit, funktionell identische Läsionen bei Tieren zu erzeugen. In der Tat haben die Forscher betont, dass die Beziehung zwischen dem Ausmaß der Verletzung und der Bewegungsfunktion der Gliedmaßenmuskulatur (quantifiziert durch den Basso-, Beattie- und Bresnahan-Score (BBB)²⁴) nicht linear ist^27,28. In früheren Studien haben wir keinen Zusammenhang zwischen dem Ausmaß des C₂SH und dem Ausmaß der Erholung der eupneischen iDIAm EMG-Aktivität nach einer Verletzung gefunden 10,29,30,31, obwohl andere Forscher über einen Zusammenhang zwischen der Beatmungsfunktion und dem Ausmaß der Schonung der weißen Substanz berichtet haben ⁵. Daher ist im Falle des C₂SH-Modells ein Ansatz zur funktionellen Validierung der iDIAm-Inaktivität zum Zeitpunkt der Operation und vorzugsweise zu Beginn des Zeitverlaufs von Experimenten mit chronischen Rückenmarksverletzungen sowohl vorteilhaft als auch notwendig.

Der vorliegende Artikel unterstreicht die Verwendung von DIAm EMG zur Echtzeit-Bestätigung des anfänglichen Verlustes von DIAm EMG während der Atmung nach dem C₂SH sowie die anschließende Bestätigungsbeurteilung 3 Tage (Tag 3) nach der Verletzung 18,21,31,32,33. In früheren Arbeiten mit dem C₂SH-Modell wurden wiederholte Laparotomien durchgeführt, um das DIAm EMG 10,13,30,34 aufzuzeichnen. In neueren Arbeiten wurden jedoch chronische EMG-Elektroden verwendet, die die Aufzeichnung von EMG bei anästhesierten und wachen Ratten ermöglichen. Darüber hinaus verringern chronische Elektroden das Risiko eines Pneumothorax und erfordern keine wiederholten Laparotomien, die zu einer Hemmung des DIAm^{führen können 35,36}. Obwohl Versionen des C₂SH-Modells von vielen Forschern verwendet wurden, wurde zum Zeitpunkt der Operation keine Bestätigung für die Stilllegung der iDIAm-Aktivität vorgenommen 3,4,6,7,11,22,23. Ohne eine solche Bestätigung der Inaktivität ist es schwierig zu wissen, welcher Anteil der nachfolgenden Genesung auf die Neuroplastizität von ipsilateralen und kontralateralen Signalwegen zurückzuführen ist, was unterschiedliche Auswirkungen haben kann. Dies ist eine wichtige Überlegung, da der inspiratorische neuronale Antrieb vom rVRG zu den phrenischen Motoneuronen primär ipsilateral ist, mit einem Verlust von etwa 50% der exzitatorischen glutamatergen Inputs zu phrenischen Motoneuronen nach C₂SH³³. Es gibt jedoch verbleibende inspiratorische exzitatorische Inputs aus dem kontralateralen rVRG, die unterhalb der Stelle der Läsion kreuzen, um ipsilaterale phrenische Motoneuronen zu innervieren, und die durch Neuroplastizität verstärkt werden können, um die funktionelle Wiederherstellung zu fördern. Durch das Entfernen des vorherrschenden ipsilateralen exzitatorischen Inputs zu phrenischen Motoneuronen geht die eupneische iDIAm-EMG-Aktivität verloren (zumindest unter Narkose), während die Aktivität des cDIAm anhält und sogar verstärkt wird. Der Verlust der iDIAm EMG-Aktivität während der Atmung ist somit ein Maß für eine erfolgreiche C₂SH (Abbildung 2).

Ein gewisses Maß an iDIAm-EMG-Aktivität ist bereits 1-4 Tage nach C₂SH bei wachen Tieren vorhanden^23,37. Darüber hinaus ist bei Dezerebrattieren die iDIAm-Aktivität innerhalb von Minuten bis Stunden nach der oberen zervikalen Hemisektion vorhanden und wird durch Anästhesie unterdrückt³⁸. Zusätzlich wird der Erfolg des C₂SH validiert, indem das Fehlen einer iDIAm EMG-Aktivität während der Atmung (Eupnoe) bei anästhesierten Ratten am Tag 3 nach der Verletzung bestätigt wird. Konfokale bildgebende Untersuchungen bestätigten den Verlust glutamaterger synaptischer Inputs an phrenischen Motoneuronen während dieses Anfangsstadiums der Verletzung³⁷. Wenn am Tag 3 nach der Verletzung eine verbleibende eupneische iDIAm-EMG-Aktivität vorhanden ist, wird dies als Beweis für eine unvollständige Entfernung des ipsilateralen absteigenden Inspirationsantriebs aus dem rVRG interpretiert. Der vorliegende Artikel gliedert sich in drei Abschnitte: (1) chronische DIAm-EMG-Aufzeichnungen, (2) C₂SH und (3) EMG-Datenerfassung bei wachen und anästhesierten Tieren. Dieses Protokoll beschreibt ein rigoroses, reproduzierbares und zuverlässiges C₂SH-Modell der cSCI bei Ratten, das eine hervorragende Plattform für die Untersuchung der respiratorischen Neuroplastizität, der kompensatorischen cDIAm-Aktivität sowie therapeutischer Strategien und Arzneimittel darstellt.