Avaliação da recuperação funcional da atividade do diafragma eupneico após hemissecção unilateral da medula espinhal cervical em ratos

Existem mais de 300.000 indivíduos com lesão medular (LM) nos Estados Unidos, aproximadamente metade dos quais tem lesões cervicais¹. Essas lesões resultam em perda significativa de bem-estar e colocam uma pressão financeira sobre os indivíduos, suas famílias e o sistema de saúde. Felizmente, a maioria dos LMEs está incompleta – fornecendo o potencial para o fortalecimento das vias poupadas¹. Essa neuroplasticidade pode permitir a recuperação de pelo menos algumas funções, incluindo a atividade do DIAm, que é importante para comportamentos ventilatórios e não ventilatórios. Assim, promover a neuroplasticidade é um caminho promissor de pesquisa para ajudar indivíduos com LM².

Modelos de LM em roedores têm o potencial de contribuir substancialmente para a descoberta de tratamentos para melhorar a saúde humana. Um dos modelos clássicos de LM utilizados para estudar a neuroplasticidade é a transecção unilateral (hemissecção) da medula espinhal em C₂ (C₂SH), que deixa o lado contralateral intacto 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. O efeito do C₂SH na produção frênica e a importância das vias contralaterais poupadas foram revelados pela primeira vez há mais de cem anos por Porter¹², cujo artigo seminal lançou as bases para estudos modernos de neuroplasticidade respiratória. O modelo C₂SH interrompe as entradas descendentes do grupo respiratório ventral rostral (rVRG) na medula, que contém neurônios pré-motores responsáveis por transmitir a saída da geração do ritmo respiratório¹⁴. Esses neurônios pré-motores rVRG também transmitem impulso neural excitatório para neurônios motores frênicos (Figura 1). Vários pesquisadores adotaram abordagens diferentes para o modelo C₂SH 10,11,15,16, o que pode explicar parcialmente parte da variabilidade na recuperação entre os estudos. Resumidamente, as abordagens variam em termos de poupar os funículos dorsais, realizar uma hemissecção completa ou realizar uma transecção parcial lateral que não interrompa completamente as entradas descendentes do rVRG ipsilateral. Geralmente, os modelos C₂SH são particularmente úteis para estudar a neuroplasticidade respiratória devido às taxas de recuperação espontânea da atividade eletromiográfica (EMG) eupneica iDIAm ao longo do tempo, que pode ser melhorada por vários fatores, incluindo sinalização neurotrófica 17,18,19,20,21. No entanto, uma perda inicial de função – definida como o silenciamento da atividade eupneica de EMG iDIAm – deve ser estabelecida antes que a recuperação possa ser claramente classificada. Essa validação da inatividade no momento da HAS C₂não é feita em vários estudos 3,4,6,7,11,22,23.

As avaliações histológicas da medula espinhal excisada fornecem apenas evidências de danos à localização apropriada das vias bulboespinhais excitatórias ipsilaterais que inervam os neurônios motores frênicos na medula espinhal, mas a histologia não substitui evidências fisiológicas (por exemplo, EMG DIAm). Além disso, as avaliações histológicas são realizadas ex vivo em pontos de tempo terminais (geralmente várias semanas a meses após a lesão) e não fornecem informações em “tempo real”. Alguns pesquisadores observaram que a magnitude da lesão está relacionada à quantidade de déficit funcional ou à falta dele 5,24,25,26. É importante notar que a validade de tais alegações é provavelmente altamente dependente de como a “função” é classificada (ou seja, quais são as tarefas funcionais e como elas são quantificadas), e a variabilidade entre os estudos destaca a dificuldade de produzir lesões funcionalmente idênticas entre os animais. De fato, os pesquisadores enfatizaram que a relação entre a extensão da lesão e a função locomotora muscular dos membros (quantificada pelo escore de Basso, Beattie e Bresnahan (BBB)²⁴) não é^linear27,28. Em estudos anteriores, não encontramos relação entre a extensão da HAS C₂e a extensão da recuperação da atividade EMG eupneica iDIAm pós-lesão 10,29,30,31, embora outros pesquisadores tenham relatado uma relação entre a função ventilatória e a extensão da substância branca poupadora ⁵. Assim, no caso do modelo C₂SH, uma abordagem para validação funcional da inatividade do iDIAm no momento da cirurgia e, de preferência, no início do curso do tempo dos experimentos de lesão medular crônica é benéfica e necessária.

O presente artigo ressalta o uso do DIAm EMG para confirmação em tempo real da perda inicial do DIAm EMG durante a respiração após o C₂SH, bem como avaliações confirmatórias subsequentes aos 3 dias (Dia 3) após a lesão 18,21,31,32,33. Em trabalhos anteriores com o modelo C₂SH, laparotomias repetidas foram realizadas para registrar EMG DIAm 10,13,30,34. No entanto, trabalhos mais recentes utilizaram eletrodos EMG crônicos, que permitem o registro de EMG em ratos anestesiados e acordados. Além disso, os eletrodos crônicos reduzem o risco de pneumotórax e não requerem laparotomias repetidas, o que pode causar inibição do DIAm^35,36. Embora versões do modelo C₂SH tenham sido utilizadas por muitos pesquisadores, a confirmação do silenciamento da atividade do iDIAm não foi feita no momento da cirurgia 3,4,6,7,11,22,23. Sem essa confirmação de inatividade, é difícil saber qual parte da recuperação subsequente atribuir à neuroplasticidade das vias ipsilaterais versus contralaterais, que podem ter impactos diferenciais. Esta é uma consideração importante porque o impulso neural inspiratório do rVRG para os motoneurônios frênicos é principalmente ipsilateral, com uma perda de cerca de 50% das entradas glutamatérgicas excitatórias para os neurônios motores frênicos após C₂SH³³. No entanto, existem entradas excitatórias inspiratórias remanescentes do rVRG contralateral que decussam abaixo do local da lesão para inervar os neurônios motores frênicos ipsilaterais e podem ser fortalecidos por meio da neuroplasticidade para promover a recuperação funcional. Ao remover a entrada excitatória ipsilateral predominante para os neurônios motores frênicos, a atividade eupneica da EMG iDIAm é perdida (pelo menos sob anestesia), enquanto a atividade do cDIAm continua e é até aumentada. A perda da atividade EMG iDIAm durante a respiração é, portanto, uma medida de um sucesso de C₂SH (Figura 2).

Algum nível de atividade EMG iDIAm está presente em 1-4 dias após C₂SH em animais acordados^23,37. Além disso, em animais descerebrados, a atividade do iDIAm está presente dentro de minutos a horas após a hemissecção cervical superior e é suprimida pela anestesia³⁸. Além disso, o sucesso do C₂SH é validado pela confirmação da ausência de atividade EMG iDIAm durante a respiração (eupneia) em ratos anestesiados no dia 3 pós-lesão. Estudos de imagem confocal confirmaram a perda de entradas sinápticas glutamatérgicas nos neurônios motores frênicos durante esse estágio inicial da lesão³⁷. No dia 3 pós-lesão, se houver alguma atividade eupneica residual do iDIAm EMG, isso é interpretado como evidência de remoção incompleta do impulso inspiratório descendente ipsilateral do rVRG. O presente artigo está dividido em três seções: (1) registros crônicos de EMG DIAm, (2) C₂SH e (3) aquisição de dados EMG em animais acordados e anestesiados. Este protocolo descreve um_{modelo C2}SH rigoroso, reprodutível e confiável de cSCI em ratos, que é uma excelente plataforma para estudar a neuroplasticidade respiratória, a atividade compensatória do cDIAm e as estratégias terapêuticas e farmacêuticas.