Оценка функционального восстановления активности эвпноэ диафрагмы после односторонней шейной гемисекции спинного мозга у крыс

В Соединенных Штатах насчитывается более 300 000 человек с травмой спинного мозга (ТСМ), примерно половина из которых имеет травмы шейного отдела^1. Эти травмы приводят к значительным потерям благосостояния и создают финансовую нагрузку на людей, их семьи и систему здравоохранения. К счастью, большинство ТСМ являются неполными, что обеспечивает потенциал для укрепления спасенных путей¹. Эта нейропластичность может позволить восстановить, по крайней мере, некоторые функции, включая активность DIAm, которая важна для вентиляционного и невентиляционного поведения. Таким образом, содействие нейропластичности является многообещающим направлением исследований для помощи людям с ТСМ².

Модели ТСМ на грызунах могут внести существенный вклад в открытие методов лечения для улучшения здоровья человека. Одной из классических моделей ТСМ, используемых для изучения нейропластичности, является односторонняя перерезка (гемисекция) спинного мозга в точке_С2 (_С2SH), при которой контралатеральная сторона остается нетронутой 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. Влияние_C2SH на диафрагмальный выброс и важность щадящих контралатеральных путей были впервые обнаружены более ста лет назад^{Портером,} чья основополагающая статья заложила основу для современных исследований дыхательной нейропластичности. Модель C₂SH прерывает нисходящие входы от ростральной вентральной группы дыхания (rVRG) в продолговатом мозге, который содержит премоторные нейроны, ответственные за передачу выходных сигналов генерации дыхательного ритма¹⁴. Эти премоторные нейроны rVRG также передают возбуждающий нейронный драйв диафрагмальным моторным нейронам (рис. 1). Некоторые исследователи использовали различные подходы к модели C₂SH 10,11,15,16, что может частично объяснить некоторую вариативность восстановления в разных исследованиях. Вкратце, подходы различаются с точки зрения сохранения дорсальных фуникулов, выполнения полной гемисекции или выполнения латеральной частичной транссекции, которая не полностью прерывает нисходящие входы от ипсилатеральной rVRG. В целом, модели C₂SH особенно полезны для изучения дыхательной нейропластичности из-за скорости спонтанного восстановления электромиографической активности (ЭМГ) eupneic iDIAm с течением времени, которая может быть улучшена несколькими факторами, включая нейротрофическую передачу сигналов 17,18,19,20,21. Тем не менее, первоначальная потеря функции, определяемая как подавление активности эвноэической ЭМГ iDIAm, должна быть сначала установлена, прежде чем можно будет четко классифицировать восстановление. Такая проверка бездействия во время C₂SH не проводилась в нескольких исследованиях 3,4,6,7,11,22,23.

Гистологические оценки иссеченного спинного мозга свидетельствуют только о повреждении соответствующего расположения ипсилатеральных возбуждающих бульбоспинальных путей, иннервирующих диафрагмальные мотонейроны в спинном мозге, но гистология не заменяет физиологические доказательства (например, ДИАм ЭМГ). Кроме того, гистологические оценки проводятся in vivo в терминальных временных точках (часто через несколько недель или месяцев после травмы) и не предоставляют информацию в режиме реального времени. Некоторые исследователи отметили, что величина поражения связана с величиной функционального дефицита или его отсутствием 5,24,25,26. Важно отметить, что обоснованность таких утверждений, вероятно, в значительной степени зависит от того, как классифицируется «функция» (т.е. каковы функциональные задачи и как они количественно оцениваются), а вариативность между исследованиями подчеркивает сложность создания функционально идентичных поражений у животных. Действительно, исследователи подчеркнули, что связь между степенью травмы и опорно-двигательной функцией мышц конечностей (количественно оцененной по шкале Бассо, Битти и Бреснахана (BBB)²⁴) не является линейной^27,28. В предыдущих исследованиях мы не обнаружили связи между распространенностью_C2 SH и степенью восстановления активности эвпноэ iDIAm EMG после травмы 10,29,30,31, хотя другие исследователи сообщали о взаимосвязи между вентиляционной функцией и степенью щадящего белого вещества 5. Таким образом, в случае модели C₂SH подход к функциональной валидации бездействия iDIAm во время операции и предпочтительно на ранних этапах экспериментов с хронической травмой спинного мозга является как полезным, так и необходимым.

В настоящей статье подчеркивается использование ДИАм ЭМГ для подтверждения в реальном времени первоначальной потери ДИАм ЭМГ при дыхании после C₂SH, а также последующих подтверждающих оценок через 3 дня (день 3) после травмы 18,21,31,32,33. В более ранней работе с моделью C₂SH выполнялись повторные лапаротомии для записи DIAm EMG 10,13,30,34. Тем не менее, в более поздних работах использовались хронические электроды ЭМГ, которые позволяют регистрировать ЭМГ у крыс под наркозом и в сознании. Кроме того, хронические электроды снижают риск пневмоторакса и не требуют повторных лапаротомий, которые могут вызвать ингибирование DIAm^35,36. Несмотря на то, что версии модели C₂SH использовались многими исследователями, подтверждение подавления активности iDIAm не было сделано во время операции 3,4,6,7,11,22,23. Без такого подтверждения бездействия трудно понять, какую часть последующего восстановления отнести к нейропластичности ипсилатеральных и контралатеральных путей, которые могут оказывать дифференцированное воздействие. Это важное соображение, потому что инспираторный нервный драйв от rVRG к диафрагмальным мотонейронам является преимущественно ипсилатеральным, с потерей около 50% возбуждающих глутаматергических входов к диафрагмальным моторным нейронам после C₂SH³³. Тем не менее, существуют остаточные входы возбуждения вдоха от контралатерального rVRG, которые декуссируются ниже места поражения, иннервируя ипсилатеральные диафрагмальные мотонейроны и могут быть усилены за счет нейропластичности, способствуя функциональному восстановлению. При удалении преобладающего ипсилатерального возбуждающего входа в диафрагмальные моторные нейроны, активность эвпноэ iDIAm EMG теряется (по крайней мере, под анестезией), в то время как активность cDIAm продолжается и даже усиливается. Таким образом, потеря активности ЭМГ iDIAm во время дыхания является мерой успешного_C2SH (Рисунок 2).

Некоторый уровень активности iDIAm ЭМГ наблюдается уже через 1-4 дня после C₂SH у бодрствующих животных^23,37. Кроме того, у животных с децеребрацией активность iDIAm присутствует в течение нескольких минут или часов после верхней шейной гемисекции и подавляется анестезией³⁸. Кроме того, успех_C2SH подтверждается подтверждением отсутствия активности iDIAm EMG во время дыхания (эвпэа) у крыс, получавших анестезию, на 3-й день после травмы. Конфокальные визуализационные исследования подтвердили потерю глутаматергических синаптических входов на диафрагмальных моторных нейронах во время этой начальной стадии травмы³⁷. На 3-й день после травмы, если имеется какая-либо остаточная эвноэиновая активность iDIAm ЭМГ, это интерпретируется как свидетельство неполного удаления ипсилатерального нисходящего инспираторного драйва из rVRG. Настоящая статья разделена на три раздела: (1) запись хронической ДИАм ЭМГ, (2) С₂SH и (3) сбор данных ЭМГ у бодрствующих и обезболенных животных. Этот протокол описывает строгую, воспроизводимую и надежную C₂SH модель cSCI у крыс, которая является отличной платформой для изучения дыхательной нейропластичности, компенсаторной активности cDIAm, а также терапевтических стратегий и фармацевтических препаратов.