Canlı Floresan Mikroskobu Kullanılarak İnsan Kolonik Organoidlerinde Sitokin ile İndüklenen Hücre Ölümünün Miktar Tayini

Kolon mukozal biyopsileri, bakım standardının bir parçası olarak rutin kolonoskopi yapılan ÇH’lı hastalardan toplandı. Hasta doku örneklerinin kullanımı ve bu örneklerden kolon organoid hatlarının oluşturulması için etik onay, Cork Eğitim Hastaneleri (CREC) Klinik Araştırma Etik Kurulu’ndan alınmıştır. Helsinki Bildirgesi’ne uygun olarak tüm hastalardan yazılı bilgilendirilmiş onam alındı. Hasta biyopsileri ve kolonoidleri ile yapılan tüm doku kültürü çalışmaları, BSL2 güvenlik protokollerine uygun olarak bir biyogüvenlik kabini içinde gerçekleştirilmelidir. Kullanmadan önce tüm plastik aşınmaların steril olduğundan emin olun. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler, aletler ve yazılımlarla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın. Grubumuzun kript izolasyonu ve organoid kültürü için kullandığı protokoller, yerleşik yöntemlerden 14,15,16 uyarlanmıştır ve daha önce yayınlanmıştır 9,10,17. Aşağıdaki protokol için kolonoidler Organoid Proliferasyon Ortamı kullanılarak kültürlendi (Tablo 1). Organoid Proliferasyon Ortamı kullanılarak büyütülen kolonoidler farklılaştırılmamış ve kolonik kök hücreler için zenginleştirilmiştir. Organoid Proliferasyon Ortamının birincil bileşeni, bağırsak kök hücre niş büyüme faktörleri Wnt-3A (W), R-spondin 3 ( R ) ve Noggin (N) 15’i içeren% 50 L-WRN şartlandırılmış ortamdır. Organoid Proliferasyon Ortamı, L-WRN şartlandırılmış ortam ve Serumsuz Ortam 1: 1’in birleştirilmesiyle hazırlanır, ardından nikotinamid ve kimyasal inhibitörler ile takviye edilir (Tablo 1). 1. Kolonik kript izolasyonu ve kolonoid kültürü 48 oyuklu bir mikrotitre plakasını 37 ° C’de,% 5 CO2’de kriptlerle tohumlamadan önce en az 72 saat önceden inkübe edin.NOT: Plakanın önceden inkübe edilmesi, tohumlama sırasında bazal membran ekstraktının (BME) polimerizasyonunu hızlandırır. Kriptlerin izolasyonundan önceki akşam BME’yi 4 °C’de buz üzerinde çözün. Kolon biyopsilerini 15 mL Biyopsi Toplama Ortamı (Tablo 1) içeren bir numune toplama tüpünde toplayın ve işlemeye hazır olana kadar 4 ° C’de saklayın. Bir pipet kullanarak mümkün olduğu kadar çok Biyopsi Toplama Ortamını dikkatlice çıkarın. Örnek tüpüne 2,5 μg/mL amfoterisin B ve 100 μg/mL gentamisin ile desteklenmiş 15 mL buz gibi DPBS ekleyerek biyopsileri yıkayın. Biyopsilerden herhangi bir mukoza veya kalıntıyı ayırmak için numune tüpünü kuvvetlice çalkalayın. Biyopsilerin yerçekimi ile yerleşmesine izin verin ve bir pipet kullanarak mümkün olduğunca fazla DPBS’yi dikkatlice çıkarın.Adım 1.4’ten itibaren yıkama prosedürünü iki kez (2x) tekrarlayın. Numune tüpüne 2.5 μg/mL amfoterisin B ve 200 μg/mL gentamisin ile takviye edilmiş 10 mL enzim içermeyen hücre ayrışma reaktifi ekleyin ve 30 rpm’de sallanarak oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, kolon kriptlerini serbest bırakmak için numune tüpünü elinizle kuvvetlice yan yana sallayın. Tüpü düşük güçlü bir ışık mikroskobu kullanarak inceleyin ve süspansiyon halinde serbest bırakılan kriptleri ve kript parçalarını arayın. Görünmüyorsa, tüpü sallayın ve tekrar kontrol edin; Kriptolar askıya alınmış olarak görülene kadar tekrarlayın. 50 mL’lik bir tüpe 70 μm’lik bir hücre süzgeci takın ve kript süspansiyonunu süzgeçten süzün. Boş numune tüpüne 10 mL buz gibi soğuk Organoid Yıkama Ortamı (Tablo 1) ekleyin, ortamı çıkarın ve hücre süzgecinden geçirin. Filtrelenmiş kriptleri iki adet 15 mL’lik tüpe (tüp başına 10 mL) aktarın ve 4 °C’de 5 dakika boyunca 150 × g’da santrifüjleyin. Süpernatanı her 15 mL’lik tüpten dikkatlice çıkarın, kript peletlerini 500 μL buz gibi soğuk Organoid Yıkama Ortamında yeniden süspanse edin, kript solüsyonunu her iki 15 mL tüpten tek bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 4 ° C’de 3 dakika boyunca 400 × g’da santrifüjleyin. Süpernatanı mikrosantrifüj tüpünden dikkatlice çıkarın ve kript peletini 70 μL BME’de (oyuk başına 20 μL ve 10 μL ekstra ölü hacim) yeniden süspanse edin. Önceden inkübe edilmiş 48 oyuklu plakayı (adım 1.1) kullanarak, her bir kuyucuğun ortasına 20 μL BME/kript süspansiyonu tohumlayın (kuyucuk başına 1 BME kubbesi). Plakayı düzgün ve istikrarlı bir şekilde ters çevirin ve 37 °C, %5 CO2’de 20 dakika inkübe edin.NOT: Plakanın ters çevrilmesi, hücrelerin kuyunun plastik yüzeyine yapışmasını önler ve BME içinde dağılımlarını sağlar. Plakayı inkübatörden çıkarın. BME’nin tamamen polimerize olduğundan emin olun ve ardından kubbeleri 100 μg/mL geniş aralıklı bir antimikrobiyal reaktif ile desteklenmiş 350 μL önceden ısıtılmış Organoid Proliferasyon Ortamı ile kaplayın. Plakayı 37 °C, %5 CO2’de inkübe edin.NOT: Geniş kapsamlı antimikrobiyal reaktif, kolon biyopsileri ile ilişkili mukozal mikroplardan kontaminasyonu önlemek içindir. Sadece kript izolasyonunu takiben kültürün ilk haftası için gereklidir. Kültürün ilk haftası için geniş kapsamlı antimikrobiyal reaktif ile desteklenen, önceden ısıtılmış Organoid Proliferasyon Ortamı kullanarak ortamı haftada 2-3 kez değiştirin; Bu sürenin ardından reaktifi çıkarın. Kolonoid kültürü tamamen kurulduktan sonra (izolasyondan 1-2 hafta sonra), 10 μM ROCK-I/II inhibitörü Y-27632 ile takviye edilmiş enzimatik ayrışma reaktifini kullanarak kolonoidleri ayırın (kolonoid ayrışması ile ilgili tüm ayrıntılar için bölüm 2’ye bakınız).NOT: İlk iki pasaj (P0-1, P1-2) için, kolonoidler 1: 1/2 oranı kullanılarak genişletilmelidir; P2’den sonra, kolonoidler 1: 3/4 oranı kullanılarak geçilebilir. 1.11-1.13 adımlarını izleyerek kolonoidleri tohumlayın ve koruyun (Organoid Proliferasyon Ortamını geniş aralıklı antimikrobiyal reaktif ile takviye etmeyin). 2. Hücre ölümü testi için kolonoidlerin hazırlanması NOT: Hücre ölümü test protokolünün tamamlanması 4 gün sürer (Şekil 1A). 48 oyuklu bir plaka formatı kullanarak kolonoidleri genişletin, oyuk başına 20 μL BME / kript süspansiyonu tohumlayın, 37 ° C,% 5 CO2’de inkübe edin ve ortamı haftada 2-3 kez değiştirin (kuyu başına 350 μL). Hücre ölümü testi için hasattan yaklaşık 1 hafta önce kolonoidleri geçin. Kolonoidleri hasat etmeden önce, yüksek bir yoğunluğa (Şekil 1Bi) çoğaltıldıklarından, çaplarının yaklaşık 25-50 μm olduğundan ve aktif olarak çoğaldıklarından emin olun.NOT: Bu test için pasaj 3’ten pasaj 14’e kadar tutarlı sonuçlarla kolonoidler kullandık. Bununla birlikte, kolonoidlerin sitokinlere transkripsiyonel yanıtının kültür süresine bağlı olarak değişebileceği gösterilmiştir18. Bu temelde, 15. pasajdan sonra bu test için kolonoidlerin kullanılmamasını öneririz. 96 oyuklu mikrotitre plakalarını 37 ° C’de,% 5 CO2’de kolonoid hücrelerle tohumlamadan önce en az 72 saat önceden inkübe edin. Deneye başlamadan önceki akşam BME’yi 4 °C’de buz üzerinde çözdürün. 10 μM ROCK-I/II inhibitörü Y-27632 ile takviye ederek yeterli miktarda enzimatik ayrışma reaktifi (kolonoid oyuğu başına 500 μL) hazırlayın. Ortamı kolonoid içeren kuyucuklardan yavaşça çıkarın; Kolonoid kubbeye zarar vermemek için kuyu kenarından pipetleyin. Her oyuğa 300 μL enzimatik ayrışma reaktifi ekleyin.Her kuyucuk için, bir P1000 pipetinin ucuyla kuyu yüzeyini kazıyarak ve hücre süspansiyonunu yukarı ve aşağı pipetleyerek kolonoid kubbeyi parçalayın; Hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçınmaya çalışın. Hücre süspansiyonunu 15 mL’lik bir tüpte toplayın.NOT: Bu 15 mL’lik tüp, 48 oyuklu plakanın 10 kuyusundan kolonoidleri toplamak için kullanılacaktır. Tüm kolonoid materyalin toplandığından ve aynı 15 mL’lik tüpe aktarıldığından emin olmak için aynı kuyuyu başka bir 200 μL enzimatik ayrışma reaktifi ile yıkayın. Hasat edilen genişlemiş kolonoidlerin her bir kuyusu için bu işlemi tekrarlayın ve bunları aynı tek 15 mL tüpte toplayın.NOT: Etkili ayrışma için, tüp başına maksimum 10 kuyu kolonoid toplanmalıdır. >10 kuyucuk topluyorsanız, toplanan kolonoidleri birden fazla 15 mL’lik tüpe eşit olarak bölün. 15 mL’lik tüpü, adım 2.5.2’den toplanan kolonoidlerle 37 ° C’de 5 dakika boyunca bir su banyosunda inkübe edin. İnkübasyonun ardından, tüpü 400 × g’da 3 dakika santrifüjleyin. Tüpte yaklaşık 1.2 mL bırakarak süpernatanı nazikçe çıkarın.NOT: Bir sonraki adım, hızlı pipetleme kullanılarak kolonoidlerin fiziksel olarak ayrıştırılmasını gerektirir. Bunun etkili olması için, tüpte küçük bir hacimde hücre süspansiyonuna sahip olmanız gerekir – 15 mL’lik tüpte kalan 1.2 mL bu amaç için yeterlidir. Enzimatik ayrışma reaktifinin kalan 1.2 mL’sinde kolonoid peletini yeniden süspanse edin. 1.000 μL’ye ayarlanmış bir P1000 pipeti kullanarak, pipetin ucunu 15 mL’lik tüpün tabanının hemen üzerinde tutarak süspansiyona yerleştirin, ardından süspansiyonu ucun içine ve dışına hızla pipetleyin. Hızlı bir şekilde pipetlemek için, piston düğmesine ilk durma noktasına kadar hızlı bir şekilde basın, üst konumun yaklaşık yarısına gelene kadar düğmeyi bırakın ve tekrarlayın. Yaklaşık 10 saniye (30-40 inç) boyunca hızlı bir şekilde pipetleyin, ardından süspansiyonu tamamen yeniden süspanse edin ve pipetlemeyi tekrarlayın. 2-3 tur hızlı pipetleme yapın. Bütün kolonoid kalmadığını ve kolonoid fragmanlarının çoğunun yaklaşık 30-40 μm boyutunda olduğunu doğrulamak için numuneyi mikroskop altında kontrol edin (Şekil 1Bii). Numune daha fazla ayrışma gerektiriyorsa, 37 °C’deki su banyosunda 3 dakika daha inkübe edin, adım 2.7’deki pipetleme tekniğini tekrarlayın ve numuneyi mikroskop altında kontrol edin. Kolonoid fragmanlarının çoğu en uygun boyuta gelene kadar bu işlemi tekrarlayın.NOT: Kolonoidleri çok fazla ayırmamaya dikkat edin, çünkü bu aşırı hücre ölümüne, düşük kaplama verimliliğine ve cılız kolonoidlere neden olur. 15 mL’lik tüpe 10 mL buz gibi soğuk Organoid Yıkama Ortamı (Tablo 1) ekleyin. Tüpü 400 × g’da 3 dakika santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın, 1 mL buz gibi soğuk Organoid Yıkama Ortamında yeniden süspanse edin ve 1.5 mL’lik bir mikrosantrifüj tüpüne ( kolonoid fragman tüpü olarak adlandırılır) aktarın. Kolonoid fragman tüpünün içeriğini pipetleme ile karıştırın ve 50 μL’lik bir numune alın; bu 50 μL’lik numuneyi yeni bir 1.5 mL’lik mikrosantrifüj tüpüne (hücre sayım tüpü olarak adlandırılır) aktarın. Kolonoid fragman tüpünü bu noktadan adım 2.15’in tamamlanmasına kadar buz üzerinde saklayın. Hücre sayım tüpünü 400 × g’da 3 dakika santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın ve 10 μM ROCK-I/II inhibitörü Y-27632 ile takviye edilmiş 500 μL enzimatik ayrışma reaktifi içinde yeniden süspanse edin. Tek hücre sayım tüpünü 37 ° C’de 5 dakika su banyosunda inkübe edin. 400 μL’ye ayarlanmış bir P1000 pipeti kullanarak, numuneyi adım 2.7’de açıklandığı gibi pipetleyin ve tek hücreli bir süspansiyon olduğundan emin olmak için numuneyi mikroskop altında kontrol edin. Aksi takdirde, kolonoidler tek hücreli bir süspansiyona tamamen ayrışana kadar bu işlemi tekrarlayın. Tek hücre sayım tüpüne 1 mL Organoid Yıkama Ortamı ekleyin, 400 × g’da 3 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice çıkarın. Hücreleri 50 μL Organoid Yıkama Ortamında yeniden süspanse edin ve ardından 50 μL tripan mavisi ekleyin. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. 50 μL numunedeki hücre sayısını hesaplayın ve bunu kolonoid fragman tüpündeki hücrelerin konsantrasyonunu hesaplamak için kullanın. 96 oyuklu bir mikrotitre plakasının oyuğu başına 0,5 ×10 4 kolonoid hücresinin tohumlanacağı deney için gerekli hücre süspansiyonu hacmini hesaplayın. Ölü hacmi hesaba katmak için bu hesaplanan hacme yaklaşık fazladan ekleyin. Bu toplam hacmi kolonoid fragman tüpünden (adım 2.11) yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.Kolonoid fragmanları içeren yeni 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünü 400 × g’da 3 dakika santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın ve BME’de yeniden süspanse edin (0.5 × 104 hücre başına 10 μL BME kullanın).NOT: BME’nin fiziksel özellikleri (yüksek viskozite, sıcaklığa bağlı polimerizasyon) nedeniyle, pipetleme yoluyla önemli miktarda malzeme kaybedilebilir (ölü hacim). Kolonoid/BME süspansiyonunu içeren tüpü veya rezervuarı biyogüvenlik kabini içindeki steril bir kapta buz üzerine kurun.NOT: Tohumlama sırasında hücreleri buz üzerinde tutmak, hücre substratının erken polimerleşmesini önler. Önceden inkübe edilmiş 96 oyuklu bir mikrotitre plakası (adım 2.3’ten itibaren) kullanarak, oyuk başına 10 μL kolonoid / BME çözeltisini ters pipetleyin. Kuyu duvarına çarpmamak için ucu kuyu yüzeyinin hemen üzerine yerleştirdiğinizden ve merkeze pipetlediğinizden emin olun. Düzensiz tohumlamayı önlemek için kolonoid / BME süspansiyonunu düzenli olarak karıştırın.NOT: Mikrotitre plakasının dış kenar kuyularına kolonoid tohumlamayın.Pipeti ters çevirmek için:Pipeti ayarlayın ve ardından ilk durdurucuyu geçerek ikinci durdurucuya kadar piston düğmesine basın. Bu pozisyonu koruyarak, ucu kolonoid / BME süspansiyonuna daldırın ve pistonu yavaşça yukarı doğru bırakın. Piston düğmesine ilk durağa kadar nazikçe ve sabit bir şekilde basarak süspansiyonu dağıtın. Daha fazla kuyu ekiyorsanız, bu pozisyonu koruyun ve 2.18.1.2-2.18.1.3 adımlarını tekrarlayın. Bitirdikten sonra, piston düğmesine ikinci durdurucuya basarak kalan az miktarda süspansiyonu dışarı atın.NOT: BME’nin yüksek viskozitesi nedeniyle ters pipetleme tekniğini kullanmanızı öneririz. Plakayı düzgün ve istikrarlı bir şekilde ters çevirin ve 37 °C, %5 CO2’de 20 dakika inkübe edin. Plakayı inkübatörden çıkarın. BME’nin tamamen polimerize olduğundan emin olun ve ardından kubbeleri 200 μL önceden ısıtılmış Organoid Proliferasyon Ortamı ile kaplayın. Çevreleyen bir hendeğe sahip (buharlaşmayı azaltan) 96 oyuklu bir mikrotitre plakası kullanıyorsanız, her rezervuarı 2 mL Organoid Yıkama Ortamı ile doldurun. Kolonları 3 gün boyunca 37 ° C,% 5 CO2’de inkübe edin ve kolonoidlerin iyileştiğinden ve çoğaldığından emin olmak için günde bir kez mikroskobik olarak inceleyin. 3. Hücre ölümü testi için kolonoid tedavileri Önceden ısıtılmış Organoid Proliferasyon Ortamına floresan hücre ölüm boyası veya DMSO ekleyerek 2.5 μM’lik bir floresan hücre ölüm boyası çözeltisi (SYTOX Yeşil Nükleik Asit Boyası) ve DMSO çözeltisi hazırlayın (Tablo 2).NOT: Floresan hücre ölüm boyası stoğunu ve seyreltilmiş çözeltiyi ışıktan koruyun. SYTOX Yeşil Nükleik Asit Lekesi DMSO’da çözündürülür; DMSO çözeltisi, çözücü etkilerini kontrol etmek için Boya Yok koşulunu hazırlamak için kullanılır. Tablo 2’de gösterildiği gibi tedavileri hazırlamak için 2.5 μM floresan hücre ölüm boyası ve DMSO çözeltisini adım 3.1’deki solüsyonu kullanın. Ortamı, plakayı eğerek ve kuyucukların kenarından pipetleyerek kolonoidlerle tohumlanmış 96 oyuklu mikrotitre plakasından nazikçe çıkarın; daha sonra, kuyucuk başına 200 μL tedavi ortamı ekleyin. Maksimum Toksisite koşul(lar)ı için ekstra PBS/BSA kontrol kuyularına sahip olduğunuzdan emin olun (plaka haritası için Tablo 2’ye bakın). Kolonoidleri, görüntüleme için hazır olana kadar gerekli tedavi zaman noktaları için 37 ° C,% 5 CO2’de inkübe edin. Görüntülemeden en az 2 saat önce, steril hücre kültürü dereceli suda ‘luk bir v/v Triton-X 100 çözeltisi hazırlayın ve Maksimum Toksisite koşul(lar)ı için 22 μL ‘luk bir Triton-X 100 doğrudan kontrol kuyularının ortamına ekleyin.NOT: ‘luk bir çözelti kullanmak, yüzey aktif maddenin yüksek viskozitesi nedeniyle oluşabilecek pipetleme hatalarını azaltır. 4. Görüntü edinme Kolonoidlerle tohumlanmış 96 oyuklu mikrotitre plakasını inkübatörden çıkarın ve dijital ters çevrilmiş epifloresan mikroskobu aşamasına aktarın. Plakanın oda sıcaklığına gelmesine izin verin. Maksimum Toksisite koşulu kolonoidlerinin mikroskop altında inceleyerek tamamen parçalandığını doğrulayın (Şekil 1, Biii). Uzun çalışma mesafeli 40x floresan objektif gibi uygun bir objektif seçin. Başlamadan önce mikroskobun görüntüleme ayarlarını optimize edin.İletim kanalını kullanarak, SYTOX pozitif hücrelere sahip bir kolonoide odaklanın, Yeşil Floresan Proteine (GFP) geçinkanalını (488 nm) açın ve arka planı en aza indirirken floresan sinyalini en üst düzeye çıkarmak için ışık yoğunluğunu ve maruz kalma süresini ayarlayın. Önce düşük bir ışık yoğunluğu deneyin, ardından pozlama süresini kademeli olarak artırın; Maruz kalma süresi pratik değilse, ışık yoğunluğunu biraz artırın.NOT: Işık yoğunluğu yerine maruz kalma süresinin arttırılması, numunelerin fototoksisitesini ve fotoağartılmasını azaltacaktır19. Numuneleri yalnızca gerektiğinde floresan ışığına maruz bırakın. GFP kanalı için optimize edilmiş görüntüleme ayarlarını kullanarak, numunelerin aşırı veya az pozlanmadığından emin olmak için Boya Yok ve Maksimum Toksisite koşullarını gözlemleyin. Sonlandırıldıktan sonra, görüntüleme ayarlarını koşullar arasında tutarlı tutun. Rastgele örnekleme yaklaşımı kullanarak görüntüler elde edin: bunu, kolonoid kubbeyi kaplayan sabit bir ızgara desenini izleyen görüş alanlarını (FOV’lar) seçerek yapın. En az 10 FOV’dan kolonoidlerin görüntülerini elde edin. Kolonoidin merkezi düzleminin odakta olduğundan emin olun ve hem iletim hem de GFP kanallarında görüntüler elde edin.Aşağıdaki dışlama ölçütlerini uygulayın.FOV’da kolonoid yoksa görüntü almayın. FOV’da bulunan aynı odak düzleminde üst üste binen yalnızca kolonoidler varsa görüntü almayın (Şekil 1, Biv). FOV’da yalnızca kolonoid kalıntısı varsa görüntü almayın (Şekil 1Bv). Analize kolonoid kalıntılarını dahil etmeyin. Görüntüleri taşınabilir ağ grafik formatında kaydedin ve dışa aktarın. Ek zaman noktaları görüntülüyorsa, kolonoidli 96 oyuklu mikrotitre plakasını 37 ° C,% 5 CO2’de inkübatöre geri koyun. 5. Görüntü analizi Fiji ImageJ’yi açın ve dosyaları ImageJ araç çubuğuna sürükleyip bırakarak veya Dosya | Dosyaları açın ve seçin. Açıldıktan sonra, Image| Yığınlar| Yığınlanacak görüntüler. Görüntü yığınını 8 bitlik dosya biçimine dönüştürmek için Görüntü| Türü| 8 bit. Her görüntü seti için, ImageJ araç çubuğundaki Freehand Seçimleri aracını tıklatın ve bilgisayar faresini kullanarak iletim görüntüsündeki ilgi alanını (ROI) manuel olarak seçin; ROI, kolonoidin çevresidir. Ardından, görüntü yığını arasında karşılık gelen GFP kanalı görüntüsüne geçiş yapın. Analiz Et| Ölçümleri ayarlayın; Ölçüleri Ayarla iletişim penceresinde, Ortalama Gri Değer’i işaretleyin ve diğer tüm kutuları işaretlemeden bırakın. GFP görüntüsü seçiliyken, Analiz Et | Ölçün. Görüntü yığınındaki her kolonoid için bu analizi tekrarlayın. Veri kümesi analiz edildikten sonra, Sonuçlar penceresindeki tüm verileri kopyalayın ve bunları bir elektronik tablo yazılım uygulamasına yapıştırın. 6.% maksimum toksisite hesaplaması Denklem (1)’i kullanarak her koşul için teknik kopya Ortalama Gri Değerlerin (MGV) ortalamasını hesaplayın. (tedavi ortalaması A) = (1) Denklem (2) kullanarak her koşulun ortalamasını Maksimum Toksisite koşulunun (MT) ortalamasına göre yüzde olarak ifade edin.%MTa = (2) 7. TÜFE’nin hesaplanması Adım 6.1’de hesaplanan ortalama değerleri kullanarak verileri aşağıdaki gibi normalleştirin (NORM), her tedavi koşulundan ve Maksimum Toksisite (MT) koşulundan Tedavi Edilmemiş durumun (UT) ortalamasını çıkarın (sitokin tedavisinden bağımsız olarak meydana gelen arka plan hücre ölümünü çıkarmak için). Ardından, her bir tedavi koşulunu, denklem (3)’te gösterildiği gibi Maksimum Toksisite (MT) koşulunun arka plan çıkarılmış ortalamasına bölün.NORMA = (3) Adım 7.1’de hesaplanan normalleştirilmiş değerleri 1’den çıkarın; Elde edilen değerler, tedaviden sonra hücre canlılığını (V) temsil eder (aşağıdaki denklem (4)’te olduğu gibi).VA = 1 −NORMA (4) Denklem (5) kullanarak pertürbagen etkileşim katsayısını (CPI) hesaplayın:TÜFE = (5)A’nın ilk tedaviyi ifade ettiği yerde; B ikinci tedaviyi belirtir; Ve AB kombinasyon tedavisidir. CPI değerleri sinerjik (1) ilişkileri gösterir.