Kwantificering van cytokine-geïnduceerde celdood in menselijke colonorganoïden met behulp van live fluorescentiemicroscopie

Colonslijmvliesbiopten werden verzameld van patiënten met de ziekte van Crohn die routinematige colonoscopie ondergingen als onderdeel van de standaardbehandeling. Ethische goedkeuring voor het gebruik van weefselmonsters van patiënten en het genereren van colonorganoïdelijnen uit deze monsters werd verkregen van de Clinical Research Ethics Committee van de Cork Teaching Hospitals (CREC). Van alle patiënten werd schriftelijke geïnformeerde toestemming verkregen in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki. Alle weefselkweekwerkzaamheden met biopsieën en colonoïden van de patiënt moeten worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast volgens de BSL2-veiligheidsprotocollen. Zorg ervoor dat alle plastic slijtage steriel is voor gebruik. Zie de Materiaaltabel voor details met betrekking tot alle materialen, reagentia, instrumenten en software die in dit protocol worden gebruikt. De protocollen die onze groep gebruikt voor crypte-isolatie en organoïdecultuur zijn aangepast van de gevestigde methoden 14,15,16 en zijn eerder gepubliceerd 9,10,17. Voor het volgende protocol werden colonoïden gekweekt met behulp van organoïde proliferatiemedia (tabel 1). Colonoïden gekweekt met behulp van organoïde proliferatiemedia zijn ongedifferentieerd en verrijkt voor colonstamcellen. Het primaire bestanddeel van organoïde proliferatiemedia is 50% L-WRN geconditioneerde media, die de intestinale stamcel-nichegroeifactoren Wnt-3A (W), R-spondine 3 (R) en Noggin (N)15 bevatten. Organoïde proliferatiemedia wordt bereid door L-WRN-geconditioneerde media en serumvrije media 1:1 te combineren, gevolgd door suppletie met nicotinamide en chemische remmers (tabel 1). 1. Isolatie van de crypte van de dikke darm en cultuur van de dikke darm Pre-incubeer een microtiterplaat met 48 putjes bij 37 °C, 5% CO2 gedurende minimaal 72 uur voordat u het met crypten bezaait.OPMERKING: Het voorincuberen van de plaat versnelt de polymerisatie van het basaalmembraanextract (BME) tijdens het zaaien. Ontdooi de BME op ijs bij 4 °C de avond voor de isolatie van de crypten. Verzamel de dikke darmbiopten in een monsterafnamebuisje met 15 ml biopsieafnamemedium (tabel 1) en bewaar bij 4 °C tot ze klaar zijn voor verwerking. Verwijder voorzichtig zoveel mogelijk Biopsy Collection Medium met behulp van een pipet. Was de biopsieën door 15 ml ijskoude DPBS aangevuld met 2,5 μg/ml amfotericine B en 100 μg/ml gentamicine toe te voegen aan het monsterbuisje. Schud het monsterbuisje krachtig om slijm of vuil van de biopsieën te scheiden. Laat de biopsieën door de zwaartekracht bezinken en verwijder voorzichtig zoveel mogelijk DPBS met behulp van een pipet.Herhaal de wasprocedure uit stap 1.4 twee keer (2x). Voeg 10 ml enzymvrije celdissociatiereagens aangevuld met 2,5 μg/ml amfotericine B en 200 μg/ml gentamicine toe aan het monsterbuisje en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur met schommelen op 30 rpm. Schud na de incubatie de monsterbuis krachtig heen en weer met de hand om de darmcrypten los te maken. Inspecteer de buis met een microscoop met laag vermogen en zoek naar de vrijgekomen crypten en cryptefragmenten in suspensie. Als het niet zichtbaar is, schud dan de tube en controleer opnieuw; Herhaal dit totdat de crypten in suspensie worden gezien. Sluit een celzeef van 70 μm aan op een buisje van 50 ml en filtreer de cryptsuspensie door de zeef. Voeg 10 ml ijskoud organoïde wasmiddel (tabel 1) toe aan het lege monsterbuisje, verwijder het medium en haal het door de celzeef. Breng de gefilterde crypten over in twee buisjes van 15 ml (10 ml per buisje) en centrifugeer bij 4 °C gedurende 5 minuten bij 150 × g. Verwijder het supernatans voorzichtig uit elke tube van 15 ml, resuspendeer de cryptepellets in 500 μl ijskoude organoïde wasmedia, breng de crypteoplossing over van beide buisjes van 15 ml naar een enkele microcentrifugebuis van 1,5 ml en centrifugeer bij 4 °C gedurende 3 minuten bij 400 × g. Verwijder het supernatans voorzichtig uit de microcentrifugebuis en resuspendeer de cryptekorrel in 70 μL BME (20 μL per putje en 10 μL extra dood volume). Gebruik de voorgeïncubeerde plaat met 48 putjes (stap 1.1) om 20 μL BME/cryptussuspensie in het midden van elk putje te zaaien (1 BME-koepel per putje). Keer de plaat soepel en gestaag om en incubeer bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 20 min.OPMERKING: Het omkeren van de plaat voorkomt dat cellen zich hechten aan het plastic oppervlak van de put en zorgt voor hun verdeling binnen de BME. Haal de plaat uit de couveuse. Zorg ervoor dat de BME volledig is gepolymeriseerd en bedek de koepels vervolgens met 350 μL voorverwarmde organoïde proliferatiemedia aangevuld met 100 μg/ml van een breed antimicrobieel reagens. Incubeer de plaat bij 37 °C, 5% CO2.OPMERKING: Het antimicrobiële reagens met een breed scala is bedoeld om besmetting door mucosale microben die verband houden met de colonbiopsieën te voorkomen. Het is alleen nodig voor de eerste week van de cultuur na isolatie van de crypte. Vervang de media 2-3x per week met behulp van voorverwarmde organoïde proliferatiemedia, aangevuld met het brede antimicrobiële reagens voor de eerste week van de kweek; Verwijder na deze periode het reagens. Zodra de colonoïdcultuur volledig is gevestigd (1-2 weken na isolatie), dissocieert u de colonoïden met behulp van het enzymatische dissociatiereagens aangevuld met 10 μM van de ROCK-I/II-remmer Y-27632 (zie rubriek 2 voor volledige details over colonoïde dissociatie).OPMERKING: Voor de eerste twee passages (P0-1, P1-2) moeten colonoïden worden uitgebreid met een verhouding van 1:1/2; na P2 kunnen colonoïden worden gepasseerd met een verhouding van 1:3/4. Zaai en onderhoud de colonoïden volgens de stappen 1.11-1.13 (vul Organoid Proliferation Media niet aan met het brede antimicrobiële reagens). 2. Bereiding van colonoïden voor celdoodtest OPMERKING: Het protocol voor de celdoodtest duurt 4 dagen om te voltooien (Figuur 1A). Breid de colonoïden uit met behulp van een plaatformaat met 48 putjes, zaai 20 μL BME/cryptsuspensie per putje, incubeer bij 37 °C, 5% CO2 en vervang het medium 2-3x per week (350 μL per putje). Passage de colonoïden ongeveer 1 week voor het oogsten voor de celdoodtest. Voordat u de colonoïden oogst, moet u ervoor zorgen dat ze worden vermeerderd tot een hoge dichtheid (Figuur 1Bi), dat ze een diameter van ongeveer 25-50 μm hebben en actief prolifereren.OPMERKING: We hebben colonoïden gebruikt voor deze test van doorgang 3 tot doorgang 14 met consistente resultaten. Het is echter aangetoond dat de transcriptionele respons van colonoïden op cytokines kan veranderen afhankelijk van de duur van de kweek18. Op basis hiervan raden we aan om na passage 15 geen colonoïden meer te gebruiken voor deze test. Pre-incubeer microtiterplaten met 96 putjes bij 37 °C, 5% CO2 gedurende minimaal 72 uur voordat ze met colonoïde cellen worden gezaaid. Ontdooi de BME de avond voor aanvang van het experiment op ijs bij 4 °C. Bereid een voldoende volume van het enzymatische dissociatiereagens (500 μL per putje colonoïden) door suppletie met 10 μM van de ROCK-I/II-remmer Y-27632. Verwijder voorzichtig het medium uit de putjes die colonoïden bevatten; pipet vanaf de rand van de put om beschadiging van de colonoïde koepel te voorkomen. Voeg 300 μL enzymatisch dissociatiereagens toe aan elk putje.Breek voor elk putje de colonoïde koepel uit elkaar door met de punt van een P1000-pipet over het oppervlak van het putje te schrapen en de celsuspensie op en neer te pipetteren; Probeer te voorkomen dat er luchtbellen ontstaan. Vang de celsuspensie op in een buisje van 15 ml.OPMERKING: Deze buis van 15 ml zal worden gebruikt om colonoïden te verzamelen uit 10 putjes van de plaat met 48 putjes. Was hetzelfde putje met nog eens 200 μL van het enzymatische dissociatiereagens om ervoor te zorgen dat al het colonoïde materiaal wordt verzameld en overgebracht naar hetzelfde buisje van 15 ml. Herhaal dit proces voor elk putje met geëxpandeerde colonoïden dat wordt geoogst en verzamel ze in dezelfde enkele buis van 15 ml.OPMERKING: Voor een efficiënte dissociatie mogen maximaal 10 putjes colonoïden per buisje worden verzameld. Als u >10 putjes verzamelt, verdeel de verzamelde colonoïden dan gelijkmatig over meerdere buisjes van 15 ml. Incubeer de 15 ml tube met verzamelde colonoïden uit stap 2.5.2 in een waterbad bij 37 °C gedurende 5 min. Centrifugeer de buis na de incubatie gedurende 3 minuten bij 400 × g. Verwijder het supernatant voorzichtig en laat ongeveer 1,2 ml achter in de buis.OPMERKING: De volgende stap vereist de fysieke dissociatie van colonoïden met behulp van snel pipetteren. Om dit effectief te laten zijn, moet u een kleine hoeveelheid celsuspensie in de buis hebben – de 1,2 ml die nog in de buis van 15 ml zit, is voldoende voor dit doel. Resuspendeer de colonoïde pellet in de resterende 1,2 ml van het enzymatische dissociatiereagens. Gebruik een P1000-pipet die is ingesteld op 1.000 μl, plaats de punt van de pipet in de suspensie, houd deze net boven de bodem van de buis van 15 ml, en pipetteer de suspensie vervolgens snel in en uit de tip. Om snel te pipetten, drukt u de zuigerknop snel in tot de eerste stop, laat u de knop los tot deze ongeveer halverwege de bovenste positie is en herhaalt u. Pipeteer snel gedurende ongeveer 10 s (30-40 depressies), repsureer de suspensie vervolgens volledig en herhaal het pipetteren. Voer 2-3 rondes snel pipetteren uit. Controleer het monster onder de microscoop om er zeker van te zijn dat er geen hele colonoïden meer over zijn en dat de meeste colonoïde fragmenten ongeveer 30-40 μm groot zijn (Figuur 1Bii). Als het monster verder moet worden ontleed, incubeer het dan nog 3 minuten in het waterbad bij 37 °C, herhaal de pipetteertechniek in stap 2.7 en controleer het monster onder de microscoop. Herhaal dit proces totdat de meerderheid van de colonoïde fragmenten de optimale grootte heeft.OPMERKING: Pas op dat u de colonoïden niet te veel dissocieert, omdat dit zal resulteren in overmatige celdood, lage plating-efficiëntie en ondermaatse colonoïden. Voeg 10 ml ijskoud organoïde wasmiddel (tabel 1) toe aan de tube van 15 ml. Centrifugeer de buis gedurende 3 minuten op 400 × g, verwijder het supernatant, resuspendeer in 1 ml ijskoude Organoid Wash Media en breng over naar een microcentrifugebuis van 1,5 ml (de zogenaamde colonoïde fragmentbuis). Meng de inhoud van de buis met colonoïde fragmenten door te pipetteren en neem een monster van 50 μl; breng dit monster van 50 μl over in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml (ook wel de celgetalbuis genoemd). Bewaar de buis van het colonoïde fragment vanaf dit punt op ijs tot de voltooiing van stap 2.15. Centrifugeer de celgetalbuis gedurende 3 minuten bij 400 × g, verwijder het supernatant en resuspendeer in 500 μL enzymatisch dissociatiereagens aangevuld met 10 μM van de ROCK-I/II-remmer Y-27632. Incubeer de buis met een celgetal gedurende 5 minuten in het waterbad bij 37 °C. Gebruik een P1000-pipet die is ingesteld op 400 μl om het monster te pipetteren zoals beschreven in stap 2.7 en controleer het monster onder de microscoop om er zeker van te zijn dat er een eencellige suspensie is. Als dit niet het geval is, herhaalt u dit proces totdat de colonoïden volledig zijn gedissocieerd tot een eencellige suspensie. Voeg 1 ml organoïde wasmedia toe aan de buis met een celgetal, centrifugeer gedurende 3 minuten op 400 × g en verwijder voorzichtig het supernatant. Resuspendeer de cellen in 50 μL Organoid Wash Media en voeg vervolgens 50 μL trypanblauw toe. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer. Bereken het aantal cellen in het monster van 50 μl en gebruik dit om de concentratie van cellen in de buis van het colonoïde fragment te berekenen. Bereken het volume celsuspensie dat nodig is voor het experiment waarbij 0,5 ×10 4 colonoïde cellen worden gezaaid per putje van een microtiterplaat met 96 putjes. Voeg ongeveer 15% extra toe aan dit berekende volume om rekening te houden met het dode volume. Breng dit totale volume over van de buis met colonoïde fragmenten (stap 2.11) naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml.Centrifugeer de nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml met colonoïde fragmenten gedurende 3 minuten bij 400 × g, verwijder de supernatant en resuspendeer in BME (gebruik 10 μL BME per 0,5 ×10 4 cellen).OPMERKING: Vanwege de fysische eigenschappen van de BME (hoge viscositeit, temperatuurafhankelijke polymerisatie) kan een aanzienlijke hoeveelheid materiaal verloren gaan door pipetteren (dood volume). Plaats de buis of het reservoir met de colonoïde/BME-suspensie op ijs in een steriele container in de bioveiligheidskast.OPMERKING: Door de cellen tijdens het zaaien op ijs te houden, wordt voorkomen dat het celsubstraat voortijdig polymeriseert. Gebruik een voorgeïncubeerde microtiterplaat met 96 putjes (uit stap 2.3) om 10 μl van de colonoïde/BME-oplossing per putje omgekeerd. Zorg ervoor dat u de punt net boven het oppervlak van de put plaatst en pipette in het midden om te voorkomen dat u de wand van de put raakt. Meng de colonoïde/BME-suspensie regelmatig om ongelijkmatig zaaien te voorkomen.OPMERKING: Zaai geen colonoïden in de buitenste randputjes van de microtiterplaat.Om de pipet om te keren:Stel de pipet in en druk vervolgens de plunjerknop voorbij de eerste stop naar de tweede stop. Houd deze positie vast, dompel de punt onder in de colonoïde/BME-suspensie en laat de zuiger langzaam naar boven los. Geef de suspensie af door de plunjerknop voorzichtig en gestaag tot aan de eerste aanslag in te drukken. Als u meer putjes zaait, houd deze positie dan vast en herhaal de stappen 2.18.1.2-2.18.1.3. Als u klaar bent, verwijdert u de kleine hoeveelheid resterende suspensie door de plunjerknop tot aan de tweede stop te drukken.OPMERKING: We raden aan om de omgekeerde pipetteertechniek te gebruiken vanwege de hoge viscositeit van de BME. Keer de plaat soepel en gestaag om en incubeer bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 20 min. Haal de plaat uit de couveuse. Zorg ervoor dat de BME volledig is gepolymeriseerd en bedek vervolgens de koepels met 200 μL voorverwarmde organoïde proliferatiemedia. Als u een microtiterplaat met 96 putjes gebruikt met een omringende slotgracht (die verdamping vermindert), vul dan elk reservoir met 2 ml Organoid Wash Media. Incubeer de colonoïden gedurende 3 dagen bij 37 °C, 5% CO2 en inspecteer eenmaal per dag microscopisch om er zeker van te zijn dat de colonoïden zijn hersteld en zich vermenigvuldigen. 3. Coloïde behandelingen voor celdoodtest Bereid een 2,5 μM-oplossing van fluorescerende celdoodkleurstof (SYTOX Green Nucleic Acid Stain) en DMSO-oplossing door fluorescerende celdoodkleurstof of DMSO toe te voegen aan voorverwarmde organoïde proliferatiemedia (tabel 2).OPMERKING: Bescherm de fluorescerende celdood, de kleurstof en de verdunde oplossing tegen licht. SYTOX Groene Nucleïnezuurkleuring is opgelost in DMSO; de DMSO-oplossing wordt gebruikt om de No Dye-conditie voor te bereiden om te controleren op oplosmiddeleffecten. Gebruik de 2,5 μM-oplossing van fluorescerende celdoodkleurstof en DMSO-oplossing uit stap 3.1 om behandelingen voor te bereiden zoals weergegeven in tabel 2. Verwijder het medium voorzichtig van de met colonoïden bezaaide microtiterplaat met 96 putjes door de plaat te kantelen en vanaf de rand van de putjes te pipetteren; voeg vervolgens 200 μL behandelingsmedium per putje toe. Zorg ervoor dat u extra PBS/BSA-controleputten heeft voor de Max Toxiciteitstoestand(en) (zie Tabel 2 voor de plaatkaart). Incubeer de colonoïden bij 37 °C, 5% CO2 voor de vereiste behandelingstijdstippen tot ze klaar zijn voor beeldvorming. Bereid ten minste 2 uur voor de beeldvorming een 10% v/v-oplossing van Triton-X 100 in steriel water van celcultuurkwaliteit en voeg 22 μl van de 10% Triton-X 100 rechtstreeks toe aan het medium van de controleputjes voor de maximale toxiciteitstoestand(en) tot een eindconcentratie van 1% v/v 1 uur vóór de beeldvorming.OPMERKING: Het gebruik van een 10%-oplossing vermindert pipetteerfouten die kunnen optreden als gevolg van de hoge viscositeit van de oppervlakteactieve stof. 4. Acquisitie van afbeeldingen Verwijder de microtiterplaat met 96 putjes bezaaid met colonoïden uit de incubator en breng deze over naar de tafel van een digitale omgekeerde epifluorescentiemicroscoop. Laat de plaat op kamertemperatuur komen. Bevestig dat de colonoïden van de Max Toxiciteit-conditie volledig zijn gelyseerd door ze onder de microscoop te onderzoeken (Figuur 1Biii). Kies een geschikt objectief, zoals een 40x fluorescentieobjectief met een lange werkafstand. Optimaliseer de beeldvormingsinstellingen van de microscoop voordat u begint.Gebruik het transmissiekanaal om je te concentreren op een colonoïde met SYTOX-positieve cellen, schakel over op het Groene Fluorescerende Eiwit (GFP)kanaal (488 nm) en pas de lichtintensiteit en belichtingstijd aan om het fluorescerende signaal te maximaliseren en de achtergrond te minimaliseren. Probeer eerst een lage lichtintensiteit en verhoog vervolgens geleidelijk de belichtingstijd; Als de belichtingsduur onpraktisch is, verhoog dan de lichtintensiteit iets.OPMERKING: Door de belichtingstijd te verhogen in plaats van de lichtintensiteit, wordt de fototoxiciteit en het fotobleken van de monsters verminderd19. Stel de monsters alleen bloot aan fluorescerend licht als dat nodig is. Gebruik de geoptimaliseerde beeldvormingsinstellingen voor het GFP-kanaal om de omstandigheden Geen kleurstof en maximale toxiciteit in acht te nemen om ervoor te zorgen dat de monsters niet over- of onderbelicht zijn. Eenmaal voltooid, houdt u de beeldvormingsinstellingen consistent onder alle omstandigheden. Verkrijg afbeeldingen met behulp van een willekeurige steekproefbenadering: doe dit door gezichtsvelden (FOV’s) te selecteren die een vast rasterpatroon volgen dat de colonoïde koepel bedekt. Verkrijg afbeeldingen van colonoïden van minimaal 10 FOV’s. Zorg ervoor dat het centrale vlak van de colonoïde scherp is en verkrijg beelden in zowel transmissie- als GFP-kanalen.Pas de volgende uitsluitingscriteria toe.Maak geen afbeeldingen als er geen colonoïden in het gezichtsveld aanwezig zijn. Maak geen foto’s als er alleen colonoïden zijn die elkaar overlappen in hetzelfde brandpuntsvlak in het gezichtsveld (Figuur 1Biv). Maak geen afbeeldingen als er alleen colonoïde puin in het gezichtsveld aanwezig is (Figuur 1Bv). Neem geen colonoïde puin op in de analyse. Sla afbeeldingen op in een draagbaar grafisch netwerkformaat en exporteer. Als u extra tijdstippen in beeld brengt, plaatst u de microtiterplaat met 96 putjes en colonoïden terug in de incubator bij 37 °C, 5% CO2. 5. Analyse van het beeld Open Fiji ImageJ en importeer de afbeeldingsgegevensset door de bestanden naar de ImageJ-werkbalk te slepen en neer te zetten of naar Bestand | Open en selecteer de bestanden. Eenmaal geopend, combineert u de bestanden tot een afbeeldingsstapel door te klikken op Afbeelding| Stapels| Afbeeldingen om te stapelen. Converteer de afbeeldingsstapel naar een 8-bits bestandsindeling door te klikken op Afbeelding| Soort| 8 -bits. Klik voor elke afbeeldingsset op de ImageJ-werkbalk op de ImageJ-werkbalk en selecteer handmatig het interessegebied (ROI) op de transmissieafbeelding met de computermuis; de ROI is de omtrek van de colonoïde. Schakel vervolgens door de afbeeldingsstapel naar de bijbehorende GFP-kanaalafbeelding. Klik op Analyseren| Metingen instellen; vink in het dialoogvenster Afmetingen instellen de optie Gemiddelde grijswaarde aan en laat alle andere vakjes uitgeschakeld. Selecteer de GFP-afbeelding en klik op Analyseren | Maatregel. Herhaal deze analyse voor elke colonoïde in de afbeeldingsstapel. Zodra de gegevensset is geanalyseerd, kopieert u alle gegevens in het venster Resultaten en plakt u ze in een spreadsheetsoftwaretoepassing. 6. Berekening van de maximale toxiciteit in % Bereken het gemiddelde van de technisch gerepliceerde gemiddelde grijze waarden (MGV) voor elke voorwaarde met behulp van vergelijking (1). (gemiddelde van de behandeling a) = (1) Druk het gemiddelde van elke aandoening uit als een percentage ten opzichte van het gemiddelde van de maximale toxiciteitstoestand (MT) met behulp van vergelijking (2).%MTa = (2) 7. Berekening van de CPI Normaliseer (NORM) de gegevens als volgt, met behulp van de gemiddelde waarden berekend in stap 6.1, trek het gemiddelde van de onbehandelde aandoening (UT) af van elke behandelingsconditie en de maximale toxiciteit (MT) conditie (om de achtergrondceldood te verwijderen die onafhankelijk van cytokinebehandeling optreedt). Deel vervolgens elke behandelingsconditie door het achtergrond-afgetrokken gemiddelde van de Max Toxiciteit (MT)-conditie zoals weergegeven in vergelijking (3).NORMa = (3) Trek de in stap 7.1 berekende genormaliseerde waarden af van 1; de resulterende waarden vertegenwoordigen de levensvatbaarheid van de cel (V) na behandeling (zoals in vergelijking (4) hieronder).Va = 1 −NORMa (4) Bereken de coëfficiënt van perturbagen-interactie (CPI) met behulp van vergelijking (5):CPI = (5)Waarbij a de eerste behandeling aangeeft; b geeft de tweede behandeling aan; En AB is de combinatiebehandeling. CPI-waarden geven synergetische (1) relaties aan.