Quantifizierung des Zytokin-induzierten Zelltods in humanen Dickdarmorganoiden mittels Live-Fluoreszenzmikroskopie

Es wurden Dickdarmschleimhautbiopsien von Patienten mit Zöliakie entnommen, die sich im Rahmen der Standardbehandlung einer routinemäßigen Koloskopie unterzogen. Die ethische Genehmigung für die Verwendung von Gewebeproben von Patienten und die Generierung von Dickdarm-Organoidlinien aus diesen Proben wurde von der Ethikkommission für klinische Forschung der Cork Teaching Hospitals (CREC) eingeholt. Die schriftliche Einverständniserklärung aller Patienten wurde in Übereinstimmung mit der Erklärung von Helsinki eingeholt. Alle Gewebekulturarbeiten mit Patientenbiopsien und Kolonoiden müssen in einer Biosicherheitswerkbank gemäß den BSL2-Sicherheitsprotokollen durchgeführt werden. Stellen Sie sicher, dass alle Kunststoffabdrücke vor der Verwendung steril sind. In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Reagenzien, Instrumenten und Software, die in diesem Protokoll verwendet werden. Die Protokolle, die unsere Gruppe für die Kryptenisolierung und die Organoidkultur verwendet, wurden von den etablierten Methoden14,15,16 übernommenund bereits veröffentlicht 9,10,17. Für das folgende Protokoll wurden die Kolonoide unter Verwendung von Organoid-Proliferationsmedien kultiviert (Tabelle 1). Koloide, die mit Organoid-Proliferationsmedien gezüchtet wurden, sind undifferenziert und für Dickdarmstammzellen angereichert. Der Hauptbestandteil von Organoid-Proliferationsmedien besteht zu 50 % aus L-WRN-konditionierten Medien, die die Nischenwachstumsfaktoren Wnt-3A (W), R-Spondin 3 (R) und Noggin (N)15 enthalten. Organoide Proliferationsmedien werden durch die Kombination von L-WRN-konditionierten Medien und serumfreien Medien 1:1 hergestellt, gefolgt von einer Supplementierung mit Nicotinamid und chemischen Inhibitoren (Tabelle 1). 1. Isolierung von Kolonkrypten und Kolonoidkultur Eine 48-Well-Mikrotiterplatte bei 37 °C und 5 % CO2 für mindestens 72 Stunden vorinkubieren, bevor Sie sie mit Krypten bepflanzen.HINWEIS: Die Vorinkubation der Platte beschleunigt die Polymerisation des Basalmembranextrakts (BME) während der Aussaat. Tauen Sie den BME am Abend vor der Isolierung der Krypten bei 4 °C auf Eis auf. Die Dickdarmbiopsien werden in einem Probenentnahmeröhrchen mit 15 ml Biopsie-Entnahmemedium (Tabelle 1) entnommen und bis zur Verarbeitung bei 4 °C gelagert. Entfernen Sie vorsichtig so viel Biopsie-Entnahmemedium wie möglich mit einer Pipette. Waschen Sie die Biopsien, indem Sie 15 ml eiskaltes DPBS, ergänzt mit 2,5 μg/ml Amphotericin B und 100 μg/ml Gentamicin, in das Probenröhrchen geben. Schütteln Sie das Probenröhrchen kräftig, um Schleim oder Ablagerungen von den Biopsien zu entfernen. Lassen Sie die Biopsien durch die Schwerkraft absetzen und entfernen Sie vorsichtig so viel DPBS wie möglich mit einer Pipette.Wiederholen Sie den Waschvorgang ab Schritt 1.4 zweimal (2x). Geben Sie 10 ml enzymfreies Zelldissoziationsreagenz, ergänzt mit 2,5 μg/ml Amphotericin B und 200 μg/ml Gentamicin, in das Probenröhrchen und inkubieren Sie es 15 Minuten lang bei Raumtemperatur mit Schaukeln bei 30 U/min. Schütteln Sie das Probenröhrchen nach der Inkubation kräftig von Hand zu Seite, um die Dickdarmkrypten freizugeben. Untersuchen Sie das Röhrchen mit einem Lichtmikroskop mit geringer Leistung und suchen Sie nach den freigesetzten Krypten und Kryptenfragmenten in Suspension. Wenn nicht sichtbar, schütteln Sie die Tube und prüfen Sie sie erneut. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die Krypten in der Schwebe zu sehen sind. Setzen Sie ein 70-μm-Zellsieb auf ein 50-ml-Röhrchen und filtrieren Sie die Kryptensuspension durch das Sieb. Geben Sie 10 ml eiskaltes Organoid-Waschmedium (Tabelle 1) in das leere Probenröhrchen, entfernen Sie das Medium und führen Sie es durch das Zellsieb. Die filtrierten Krypten in zwei 15-ml-Röhrchen (10 mL pro Röhrchen) überführen und 5 min bei 4 °C bei 150 × g zentrifugieren. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand von jedem 15-ml-Röhrchen, resuspendieren Sie die Kryptenpellets in 500 μl eiskaltem Organoid-Waschmedium, überführen Sie die Kryptenlösung aus beiden 15-ml-Röhrchen in ein einzelnes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie es 3 Minuten lang bei 4 °C bei 400 × g. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand aus dem Mikrozentrifugenröhrchen und resuspendieren Sie das Kryptenpellet in 70 μl BME (20 μl pro Vertiefung und 10 μl zusätzliches Totvolumen). Mit der vorinkubierten 48-Well-Platte (Schritt 1.1) werden 20 μl BME/Crypt-Suspension in die Mitte jedes Wells gesät (1 BME-Dome pro Well). Die Platte sanft und gleichmäßig umdrehen und bei 37 °C, 5 % CO2 20 min inkubieren.HINWEIS: Das Umdrehen der Platte verhindert, dass Zellen an der Kunststoffoberfläche der Vertiefung haften bleiben, und sorgt für deren Verteilung innerhalb des BME. Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator. Stellen Sie sicher, dass das BME vollständig polymerisiert ist, und überlagern Sie die Dome dann mit 350 μl vorgewärmtem Organoid-Proliferationsmedium, ergänzt mit 100 μg/ml eines antimikrobiellen Breitbandreagenzes. Die Platte wird bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert.HINWEIS: Das antimikrobielle Reagenz mit breiter Reichweite soll eine Kontamination durch Schleimhautmikroben im Zusammenhang mit den Dickdarmbiopsien verhindern. Es ist nur für die erste Woche der Kultur nach der Kryptenisolation erforderlich. Wechseln Sie das Medium 2-3x in einer Woche mit vorgewärmten Organoid-Proliferationsmedien und ergänzen Sie es in der ersten Woche der Kultur mit dem antimikrobiellen Reagenz mit breiter Reichweite; Entfernen Sie nach Ablauf dieser Zeit das Reagenz. Sobald die Kolonoidkultur vollständig etabliert ist (1-2 Wochen nach der Isolierung), dissoziieren Sie die Kolonoide mit dem enzymatischen Dissoziationsreagenz, das mit 10 μM des ROCK-I/II-Inhibitors Y-27632 ergänzt wird (siehe Abschnitt 2 für vollständige Einzelheiten zur Kolonoiddissoziation).HINWEIS: Für die ersten beiden Durchgänge (P0-1, P1-2) sollten die Koloide im Verhältnis 1:1/2 expandiert werden; nach P2 können Koloide im Verhältnis 1:3/4 durchgelassen werden. Säen und pflegen Sie die Kolnoide gemäß den Schritten 1.11-1.13 (ergänzen Sie Organoid Proliferation Media nicht mit dem breiten Spektrum antimikrobielles Reagenz). 2. Vorbereitung von Koloiden für den Zelltod-Assay HINWEIS: Das Zelltod-Assay-Protokoll dauert 4 Tage (Abbildung 1A). Expandieren Sie die Koloide mit einem 48-Well-Plattenformat, indem Sie 20 μl BME/Crypt-Suspension pro Vertiefung aussäen, bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren und das Medium 2-3x pro Woche (350 μl pro Vertiefung) wechseln. Passieren Sie die Koloide etwa 1 Woche vor der Entnahme für den Zelltod-Assay. Stellen Sie vor der Entnahme der Koloide sicher, dass sie zu einer hohen Dichte vermehrt werden (Abbildung 1Bi), dass sie einen Durchmesser von etwa 25-50 μm haben und aktiv proliferieren.HINWEIS: Wir haben für diesen Assay von Passage 3 bis Passage 14 Kolnoide mit konsistenten Ergebnissen verwendet. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass sich die transkriptionelle Reaktion von Kolonoiden auf Zytokine in Abhängigkeit von der Kulturdauer ändern kann18. Auf dieser Grundlage empfehlen wir, nach Passage 15 keine Coloide mehr für diesen Assay zu verwenden. 96-Well-Mikrotiterplatten bei 37 °C und 5 % CO2 für mindestens 72 Stunden vorinkubieren, bevor Sie sie mit Kolonoidzellen bepflanzen. Tauen Sie den BME am Abend vor Beginn des Experiments bei 4 °C auf Eis auf. Bereiten Sie ein ausreichendes Volumen des enzymatischen Dissoziationsreagenzes (500 μl pro Vertiefung Kolonoide) vor, indem Sie 10 μM des ROCK-I/II-Inhibitors Y-27632 hinzufügen. Entfernen Sie das Medium vorsichtig aus den Vertiefungen, die Koloide enthalten. Pipettieren Sie vom Rand der Vertiefung, um eine Beschädigung der Dickdarmkuppel zu vermeiden. Geben Sie 300 μl enzymatisches Dissoziationsreagenz in jede Vertiefung.Brechen Sie für jede Vertiefung die Kolonoidkuppel auseinander, indem Sie die Oberfläche der Vertiefung mit der Spitze einer P1000-Pipette abkratzen und die Zellsuspension auf und ab pipettieren. Versuchen Sie, die Bildung von Luftblasen zu vermeiden. Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 15-ml-Röhrchen.HINWEIS: Dieses 15-ml-Röhrchen wird verwendet, um Kolonoide aus 10 Vertiefungen der 48-Well-Platte zu sammeln. Waschen Sie das gleiche Gut mit weiteren 200 μl des enzymatischen Dissoziationsreagenzes, um sicherzustellen, dass das gesamte Kolonoidmaterial gesammelt und in dasselbe 15-ml-Röhrchen übertragen wird. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Vertiefung mit expandierten Kolonoiden, die entnommen werden, und sammeln Sie sie in demselben einzigen 15-ml-Röhrchen.HINWEIS: Für eine effiziente Dissoziation sollten maximal 10 Vertiefungen mit Kolonoiden pro Röhrchen gesammelt werden. Wenn Sie >10 Wells sammeln, teilen Sie die gesammelten Koloide gleichmäßig auf mehrere 15-ml-Röhrchen auf. Inkubieren Sie das 15-ml-Röhrchen mit den gesammelten Kolonoiden aus Schritt 2.5.2 in einem Wasserbad bei 37 °C für 5 min. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie das Röhrchen 3 Minuten lang bei 400 × g. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und lassen Sie etwa 1,2 ml im Röhrchen zurück.HINWEIS: Der nächste Schritt erfordert die physikalische Dissoziation der Kolonoide durch schnelles Pipettieren. Damit dies wirksam ist, müssen Sie ein kleines Volumen der Zellsuspension im Röhrchen haben – die 1,2 mL, die im 15 mL-Röhrchen verbleiben, reichen für diesen Zweck aus. Resuspendieren Sie das Kolonoid-Pellet in den verbleibenden 1,2 mL des enzymatischen Dissoziationsreagenzes. Setzen Sie mit einer P1000-Pipette auf 1.000 μl die Spitze der Pipette in die Suspension ein, halten Sie sie knapp über dem Boden des 15-ml-Röhrchens und pipettieren Sie die Suspension dann schnell in die Spitze hinein und wieder heraus. Um schnell zu pipettieren, drücken Sie den Kolbenknopf schnell bis zum ersten Anschlag, lassen Sie den Knopf los, bis er sich etwa auf halbem Weg zur oberen Position befindet, und wiederholen Sie den Vorgang. Pipettieren Sie schnell für ca. 10 s (30-40 Vertiefungen), resuspendieren Sie dann die Suspension vollständig und wiederholen Sie das Pipettieren. Führen Sie 2-3 Runden Schnellpipettieren durch. Überprüfen Sie die Probe unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass keine ganzen Kolonoide mehr vorhanden sind und dass die Mehrheit der Kolonoidfragmente etwa 30-40 μm groß ist (Abbildung 1Bii). Wenn die Probe eine weitere Dissoziation erfordert, inkubieren Sie sie weitere 3 Minuten im Wasserbad bei 37 °C, wiederholen Sie die Pipettiertechnik in Schritt 2.7 und überprüfen Sie die Probe unter dem Mikroskop. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die Mehrheit der Kolonoidfragmente die optimale Größe hat.HINWEIS: Achten Sie darauf, die Kolnoide nicht zu stark zu dissoziieren, da dies zu übermäßigem Zelltod, geringer Plattierungseffizienz und zu geringen Koloniden führt. Geben Sie 10 ml eiskaltes organoides Waschmedium (Tabelle 1) in das 15-ml-Röhrchen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen 3 Minuten lang bei 400 × g, entfernen Sie den Überstand, resuspendieren Sie es in 1 mL eiskaltem Organoid-Waschmedium und geben Sie es in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen (als Kolonoidfragmentröhrchen bezeichnet). Mischen Sie den Inhalt des Kolonoidfragmentröhrchens durch Pipettieren und entnehmen Sie eine Probe von 50 μl; Übertragen Sie diese 50-μl-Probe in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen (als Zellzählröhrchen bezeichnet). Lagern Sie das Röhrchen des Koloidfragments ab diesem Zeitpunkt bis zum Abschluss von Schritt 2.15 auf Eis. Das Zellzählröhrchen wird 3 Minuten lang bei 400 × g zentrifugiert, der Überstand entfernt und in 500 μl enzymatischem Dissoziationsreagenz resuspendiert, das mit 10 μM des ROCK-I/II-Inhibitors Y-27632 ergänzt wird. Inkubieren Sie das Einzelzellzählröhrchen im Wasserbad bei 37 °C für 5 min. Pipettieren Sie die Probe mit einer P1000-Pipette auf 400 μl wie in Schritt 2.7 beschrieben und überprüfen Sie die Probe unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass eine Einzelzellsuspension vorhanden ist. Wenn nicht, wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die Koloide vollständig in eine einzellige Suspension dissoziiert sind. Geben Sie 1 ml Organoid-Waschmedium in das Einzelzellzählröhrchen, zentrifugieren Sie 3 Minuten lang bei 400 × g und entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellen in 50 μl Organoid-Waschmedien und fügen Sie dann 50 μl Trypanblau hinzu. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Berechnen Sie die Anzahl der Zellen in der 50-μl-Probe und berechnen Sie daraus die Konzentration der Zellen im Dickdarmfragmentröhrchen. Berechnen Sie das Volumen der Zellsuspension, das für das Experiment erforderlich ist, wobei 0,5 × 104 Kolonoidzellen pro Vertiefung einer 96-Well-Mikrotiterplatte ausgesät werden. Fügen Sie diesem berechneten Volumen ca. 15 % mehr hinzu, um das Totvolumen zu berücksichtigen. Dieses Gesamtvolumen wird aus dem Gefäß des Kolonoidfragments (Schritt 2.11) in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen übertragen.Zentrifugieren Sie das neue 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit den Kolonoidfragmenten 3 Minuten lang bei 400 × g, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie es in BME (verwenden Sie 10 μl BME pro 0,5 × 104 Zellen).HINWEIS: Aufgrund der physikalischen Eigenschaften des BME (hohe Viskosität, temperaturabhängige Polymerisation) kann durch das Pipettieren eine erhebliche Menge an Material verloren gehen (Totvolumen). Stellen Sie das Röhrchen oder Reservoir mit der Kolonoid-/BME-Suspension auf Eis in einem sterilen Behälter in der Biosicherheitswerkbank auf.HINWEIS: Wenn Sie die Zellen während der Aussaat auf Eis halten, wird verhindert, dass das Zellsubstrat vorzeitig polymerisiert. Pipettieren Sie mit einer vorinkubierten 96-Well-Mikrotiterplatte (aus Schritt 2.3) 10 μl der Colonoid-/BME-Lösung pro Well rückwärts. Achten Sie darauf, die Spitze knapp über der Oberfläche der Vertiefung zu positionieren und in die Mitte zu pipettieren, um zu vermeiden, dass sie gegen die Wand der Vertiefung stößt. Mischen Sie die Colonoid-/BME-Suspension regelmäßig, um eine ungleichmäßige Aussaat zu vermeiden.HINWEIS: Säen Sie keine Kolonoide in die äußeren Randvertiefungen der Mikrotiterplatte.So kehren Sie die Pipette um:Setzen Sie die Pipette ein und drücken Sie dann den Kolbenknopf über den ersten Anschlag hinaus bis zum zweiten Anschlag. Halten Sie diese Position, tauchen Sie die Spitze in die Kolonoid-/BME-Suspension und lassen Sie den Kolben langsam nach oben los. Geben Sie die Federung ab, indem Sie den Kolbenknopf sanft und gleichmäßig bis zum ersten Anschlag drücken. Wenn Sie weitere Vertiefungen säen, halten Sie diese Position und wiederholen Sie die Schritte 2.18.1.2-2.18.1.3. Wenn Sie fertig sind, stoßen Sie die kleine Menge der verbleibenden Suspension aus, indem Sie den Kolbenknopf bis zum zweiten Anschlag drücken.HINWEIS: Aufgrund der hohen Viskosität des BME empfehlen wir die Verwendung der Reverse-Pipettiertechnik. Die Platte sanft und gleichmäßig umdrehen und bei 37 °C, 5 % CO2 20 min inkubieren. Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator. Stellen Sie sicher, dass der BME vollständig polymerisiert ist, und überlagern Sie die Kuppeln dann mit 200 μl vorgewärmtem Organoid-Proliferationsmedium. Wenn Sie eine 96-Well-Mikrotiterplatte mit einem umgebenden Graben (der die Verdunstung reduziert) verwenden, füllen Sie jedes Reservoir mit 2 ml Organoid-Waschmedium. Inkubieren Sie die Kolonoide 3 Tage lang bei 37 °C, 5 % CO2 und untersuchen Sie sie einmal täglich mikroskopisch, um sicherzustellen, dass sich die Kolonoide erholt haben und sich vermehren. 3. Colonoid-Behandlungen für den Zelltod-Assay Bereiten Sie eine 2,5-μM-Lösung aus fluoreszierendem Zelltodfarbstoff (SYTOX Green Nucleic Acid Stain) und DMSO-Lösung her, indem Sie fluoreszierenden Zelltodfarbstoff oder DMSO zu vorgewärmten Organoid-Proliferationsmedien hinzufügen (Tabelle 2).HINWEIS: Schützen Sie den fluoreszierenden Zelltod-Farbstoff und die verdünnte Lösung vor Licht. SYTOX Green Nucleic Acid Stain ist in DMSO solubilisiert; Die DMSO-Lösung wird verwendet, um den No-Dye-Zustand vorzubereiten, um Lösungsmitteleffekte zu kontrollieren. Verwenden Sie die 2,5-μM-Lösung aus fluoreszierendem Zelltodfarbstoff und DMSO-Lösung aus Schritt 3.1, um die Behandlungen vorzubereiten, wie in Tabelle 2 gezeigt. Entfernen Sie das Medium vorsichtig von der mit Kolonoiden besiedelten 96-Well-Mikrotiterplatte, indem Sie die Platte kippen und vom Rand der Wells aus pipettieren. Fügen Sie dann 200 μl Behandlungsmedium pro Vertiefung hinzu. Stellen Sie sicher, dass zusätzliche PBS/BSA-Kontrollvertiefungen für die Bedingungen/Zustände der maximalen Toxizität vorhanden sind (siehe Tabelle 2 für die Plattenkarte). Inkubieren Sie die Koloide bei 37 °C und 5 % CO2 für die erforderlichen Behandlungszeitpunkte, bis sie für die Bildgebung bereit sind. Bereiten Sie mindestens 2 Stunden vor der Bildgebung eine 10%ige v/v-Lösung von Triton-X 100 in sterilem Wasser in Zellkulturqualität vor und geben Sie 22 μl des 10%igen Triton-X 100 direkt in das Medium der Kontrollvertiefungen für die Bedingungen/Zustände der maximalen Toxizität bis zu einer Endkonzentration von 1 % v/v 1 h vor der Bildgebung.HINWEIS: Die Verwendung einer 10%igen Lösung reduziert Pipettierfehler, die aufgrund der hohen Viskosität des Tensids auftreten können. 4. Bilderfassung Nehmen Sie die mit Kolonoiden besiedelte 96-Well-Mikrotiterplatte aus dem Inkubator und stellen Sie sie auf den Tisch eines digitalen inversen Epifluoreszenzmikroskops. Lassen Sie die Platte auf Raumtemperatur kommen. Bestätigen Sie, dass die Koloide unter dem Mikroskop vollständig lysiert sind, indem Sie sie unter dem Mikroskop untersuchen (Abbildung 1Biii). Wählen Sie ein geeignetes Objektiv aus, z. B. ein 40-faches Fluoreszenzobjektiv mit großem Arbeitsabstand. Optimieren Sie die Bildgebungseinstellungen des Mikroskops, bevor Sie beginnen.Über den Übertragungskanal auf ein Kolonoid mit SYTOX-positiven Zellen fokussieren, auf das grün fluoreszierende Protein (GFP) umschalten(488 nm) und passen Sie die Lichtintensität und die Belichtungszeit an, um das Fluoreszenzsignal zu maximieren und gleichzeitig den Hintergrund zu minimieren. Versuchen Sie es zuerst mit einer niedrigen Lichtintensität und erhöhen Sie dann allmählich die Belichtungszeit. Wenn die Belichtungsdauer nicht praktikabel ist, erhöhen Sie die Lichtintensität leicht.HINWEIS: Wenn Sie die Belichtungszeit anstelle der Lichtintensität erhöhen, werden die Phototoxizität und das Photobleichen der Proben reduziert19. Setzen Sie die Proben nur bei Bedarf Fluoreszenzlicht aus. Mit den optimierten Bildgebungseinstellungen für den GFP-Kanal können Sie die Bedingungen für “Kein Farbstoff” und “Maximale Toxizität” einhalten, um sicherzustellen, dass die Proben nicht über- oder unterbelichtet werden. Halten Sie die Bildgebungseinstellungen nach der Fertigstellung zwischen den Bedingungen konsistent. Erfassen Sie Bilder mit einem Zufallsstichprobenansatz: Wählen Sie dazu Sichtfelder (FOVs) aus, die einem festen Gittermuster folgen, das die Dickdarmkuppel abdeckt. Erfassen Sie Bilder von Kolonoiden aus mindestens 10 FOVs. Stellen Sie sicher, dass die zentrale Ebene des Kolonoids scharf ist, und nehmen Sie Bilder sowohl im Übertragungs- als auch im GFP-Kanal auf.Wenden Sie die folgenden Ausschlusskriterien an.Nehmen Sie keine Bilder auf, wenn keine Kolonoide im FOV vorhanden sind. Nehmen Sie keine Bilder auf, wenn im FOV nur Koloide vorhanden sind, die sich in derselben Fokusebene überlappen (Abbildung 1Biv). Nehmen Sie keine Bilder auf, wenn sich nur Kolonoid-Ablagerungen im Sichtfeld befinden (Abbildung 1Bv). Beziehen Sie keine Dickdarmablagerungen in die Analyse ein. Speichern Sie Bilder im portablen Netzwerkgrafikformat und exportieren Sie sie. Wenn Sie zusätzliche Zeitpunkte abbilden, stellen Sie die 96-Well-Mikrotiterplatte mit den Koloiden bei 37 °C, 5 % CO2 in den Inkubator zurück. 5. Bildanalyse Öffnen Sie Fiji ImageJ und importieren Sie den Bilddatensatz, indem Sie die Dateien per Drag & Drop auf die ImageJ-Symbolleiste ziehen oder zu Datei | Öffnen Sie die Dateien und wählen Sie sie aus. Kombinieren Sie die Dateien nach dem Öffnen zu einem Bildstapel, indem Sie auf Bild| Stapel| Bilder zum Stapeln. Konvertieren Sie den Bildstapel in das 8-Bit-Dateiformat, indem Sie auf Bild| Typ| 8 -Bit. Klicken Sie für jeden Bildsatz auf das Werkzeug Freihandauswahl in der ImageJ-Symbolleiste und wählen Sie den Interessenbereich (ROI) auf dem Übertragungsbild manuell mit der Computermaus aus. Der ROI ist der Umfang des Colonoids. Wechseln Sie dann durch den Bildstapel zum entsprechenden GFP-Kanalbild. Klicken Sie auf Analysieren| Messungen einstellen; Aktivieren Sie im Dialogfeld “Messungen festlegen ” das Häkchen bei “Mittlerer Grauwert ” und lassen Sie alle anderen Kontrollkästchen deaktiviert. Wenn das GFP-Bild ausgewählt ist, klicken Sie auf Analysieren | Messen. Wiederholen Sie diese Analyse für jedes Koloid im Bildstapel. Sobald der Datensatz analysiert wurde, kopieren Sie alle Daten im Ergebnisfenster und fügen Sie sie in eine Tabellenkalkulationssoftware ein. Berechnung der maximalen Toxizität in % Berechnen Sie den Mittelwert der mittleren Grauwerte (MGV) des technischen Repliks für jede Bedingung mit Hilfe von Gleichung (1).(Mittelwert der Behandlung a) = (1) Drückt den Mittelwert jeder Bedingung in Prozent relativ zum Mittelwert der Bedingung für maximale Toxizität (MT) unter Verwendung von Gleichung (2) aus.%MTa = (2) 7. Berechnung des VPI Normalisieren (NORM) Sie die Daten wie folgt, indem Sie die in Schritt 6.1 berechneten Mittelwerte verwenden, subtrahieren Sie den Mittelwert der unbehandelten Bedingung (UT) von jeder Behandlungsbedingung und der Bedingung der maximalen Toxizität (MT) (um den Hintergrundzelltod zu entfernen, der unabhängig von der Zytokinbehandlung auftritt). Teilen Sie dann jede Behandlungsbedingung durch den hintergrundsubtrahierten Mittelwert der Bedingung für die maximale Toxizität (MT), wie in Gleichung (3) gezeigt.NORMa = (3) Subtrahieren Sie die in Schritt 7.1 berechneten normierten Werte von 1; Die resultierenden Werte stellen die Zellviabilität (V) nach der Behandlung dar (wie in Gleichung (4) unten).Va = 1 −NORMa (4) Berechnen Sie den Koeffizienten der Perturbagen-Wechselwirkung (CPI) mit Hilfe von Gleichung (5):VPI = (5)Wobei a die erste Behandlung bezeichnet; b bezeichnet die zweite Behandlung; und AB ist die Kombinationsbehandlung. CPI-Werte zeigen synergistische (1) Beziehungen an.