Quantification de la mort cellulaire induite par les cytokines dans les organoïdes du côlon humain à l’aide de la microscopie à fluorescence en direct

Des biopsies de la muqueuse colique ont été prélevées chez des patients atteints de la maladie coeliaque subissant une coloscopie de routine dans le cadre de la norme de soins. L’approbation éthique pour l’utilisation d’échantillons de tissus de patients et la génération de lignées organoïdes du côlon à partir de ces échantillons a été obtenue du Comité d’éthique de la recherche clinique des hôpitaux universitaires de Cork (CREC). Le consentement éclairé écrit de tous les patients a été obtenu, conformément à la Déclaration d’Helsinki. Tous les travaux de culture tissulaire avec des biopsies de patients et des colonoïdes doivent être effectués à l’intérieur d’une enceinte de biosécurité conformément aux protocoles de sécurité BSL2. Assurez-vous que toute usure plastique est stérile avant utilisation. Voir la table des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs, instruments et logiciels utilisés dans ce protocole. Les protocoles utilisés par notre groupe pour l’isolement des cryptes et la culture d’organoïdes ont été adaptés des méthodes établies 14,15,16 et ont été publiés précédemment 9,10,17. Pour le protocole suivant, les colonoïdes ont été cultivés à l’aide d’un milieu de prolifération organoïde (tableau 1). Les colonoïdes cultivés à l’aide d’un milieu de prolifération organoïde sont indifférenciés et enrichis en cellules souches du côlon. Le composant principal du milieu de prolifération organoïde est un milieu conditionné à 50 % par L-WRN, qui contient les facteurs de croissance de niche des cellules souches intestinales Wnt-3A (W), R-spondine 3 (R) et Noggin (N)15. Le milieu de prolifération organoïde est préparé en combinant un milieu conditionné au L-WRN et un milieu sans sérum 1:1, suivi d’une supplémentation en nicotinamide et en inhibiteurs chimiques (tableau 1). 1. Isolement de la crypte colique et culture de colonoïdes Préincuber une plaque de microtitration de 48 puits à 37 °C, 5 % de CO2 pendant au moins 72 h avant l’ensemencement avec des cryptes.REMARQUE : La préincubation de la plaque accélère la polymérisation de l’extrait de membrane basale (BME) pendant l’ensemencement. Dégivrer le BME sur glace à 4 °C la veille de l’isolement des cryptes. Prélever les biopsies du côlon dans un tube de prélèvement contenant 15 ml de milieu de prélèvement de biopsie (tableau 1) et les conserver à 4 °C jusqu’au moment de les traiter. Prélever avec précaution la plus grande quantité possible de milieu de prélèvement de biopsie à l’aide d’une pipette. Lavez les biopsies en ajoutant 15 ml de DPBS glacé complété par 2,5 μg/mL d’amphotéricine B et 100 μg/mL de gentamicine dans le tube d’échantillon. Agitez vigoureusement le tube d’échantillon pour dissocier le mucus ou les débris des biopsies. Laissez les biopsies se déposer par gravité et retirez soigneusement autant de DPBS que possible à l’aide d’une pipette.Répétez la procédure de lavage à partir de l’étape 1.4 deux fois (2x). Ajouter 10 ml de réactif de dissociation cellulaire exempt d’enzymes complété par 2,5 μg/mL d’amphotéricine B et 200 μg/mL de gentamicine dans le tube d’échantillon et incuber pendant 15 minutes à température ambiante en le balançant à 30 tr/min. Après l’incubation, secouez vigoureusement le tube d’échantillon d’un côté à l’autre pour libérer les cryptes du côlon. Inspectez le tube à l’aide d’un microscope optique de faible puissance et recherchez les cryptes libérées et les fragments de crypte en suspension. S’il n’est pas visible, secouez le tube et vérifiez à nouveau ; Répétez l’opération jusqu’à ce que les cryptes soient vues en suspension. Fixez une crépine de 70 μm à un tube de 50 mL et filtrez la suspension de la crypte à travers la crépine. Ajoutez 10 ml de produit de lavage organoïde glacé (tableau 1) dans le tube d’échantillon vide, retirez le milieu et passez-le dans la crépine de la cellule. Transvaser les cryptes filtrées dans deux tubes de 15 mL (10 mL par tube) et centrifuger à 4 °C pendant 5 min à 150 × g. Retirer soigneusement le surnageant de chaque tube de 15 mL, remettre les pastilles de la crypte en suspension dans 500 μL de produit de lavage organoïde glacé, transférer la solution de la crypte des deux tubes de 15 mL dans un seul tube de microcentrifugation de 1,5 mL et centrifuger à 4 °C pendant 3 min à 400 × g. Retirer délicatement le surnageant du tube de la microcentrifugeuse et remettre la pastille de crypte en suspension dans 70 μL de BME (20 μL par puits et 10 μL de volume mort supplémentaire). À l’aide de la plaque préincubée de 48 puits (étape 1.1), ensemencez 20 μL de suspension BME/crypte au centre de chaque puits (1 dôme BME par puits). Retournez la plaque en douceur et régulièrement et incubez à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 20 min.REMARQUE : L’inversion de la plaque empêche les cellules d’adhérer à la surface plastique du puits et assure leur distribution au sein du BME. Retirez la plaque de l’incubateur. Assurez-vous que le BME a entièrement polymérisé, puis recouvrez les dômes avec 350 μL de milieux de prolifération organoïdes préchauffés complétés par 100 μg/mL d’un réactif antimicrobien à large gamme. Incuber la plaque à 37 °C, 5% CO2.REMARQUE : Le réactif antimicrobien à large gamme doit prévenir la contamination par les microbes de la muqueuse associés aux biopsies du côlon. Il n’est requis que pour la première semaine de culture après l’isolement de la crypte. Changez le milieu 2 à 3 fois en une semaine à l’aide d’un milieu de prolifération organoïde préchauffé, en complétant avec le réactif antimicrobien à large gamme pendant la première semaine de culture ; Après cette période, retirez le réactif. Une fois que la culture de coloïdes est complètement établie (1 à 2 semaines après l’isolement), dissociez les colonoïdes à l’aide du réactif de dissociation enzymatique complété par 10 μM de l’inhibiteur de ROCK-I/II Y-27632 (voir rubrique 2 pour plus de détails sur la dissociation des colonoïdes).REMARQUE : Pour les deux premiers passages (P0-1, P1-2), les colonoïdes doivent être élargis en utilisant un rapport de 1:1/2 ; après P2, les colonoïdes peuvent être passés en utilisant un rapport de 1:3/4. Ensemencer et conserver les colonoïdes en suivant les étapes 1.11 à 1.13 (ne pas compléter le milieu de prolifération organoïde avec le réactif antimicrobien à large gamme). 2. Préparation des colonoïdes pour l’essai de mort cellulaire REMARQUE : Le protocole de test de mort cellulaire prend 4 jours (Figure 1A). Élargissez les colonoïdes à l’aide d’une plaque à 48 puits, en ensemenceant 20 μL de suspension BME/crypte par puits, en incubant à 37 °C, 5 % de CO2 et en changeant le milieu 2 à 3 fois par semaine (350 μL par puits). Passage des colonoïdes environ 1 semaine avant la récolte pour l’essai de mort cellulaire. Avant de récolter les colonoïdes, assurez-vous qu’ils sont multipliés à une densité élevée (figure 1Bi), qu’ils ont un diamètre d’environ 25 à 50 m et qu’ils prolifèrent activement.REMARQUE : Nous avons utilisé des colonoïdes pour ce test du passage 3 au passage 14 avec des résultats cohérents. Cependant, il a été démontré que la réponse transcriptionnelle des colonoïdes aux cytokines peut changer en fonction de la durée de la culture18. Sur cette base, nous recommandons de ne pas utiliser de colonoïdes pour ce test après le passage 15. Préincuber des plaques de microtitration à 96 puits à 37 °C, 5 % de CO2 pendant au moins 72 h avant d’ensemencer avec des cellules coloïdes. Décongelez le BME sur de la glace à 4 °C la veille du début de l’expérience. Préparez un volume suffisant de réactif de dissociation enzymatique (500 μL par puits de coloïdes) en complétant avec 10 μM de l’inhibiteur de ROCK-I/II Y-27632. Retirez délicatement le milieu des puits contenant des coloïdes ; Pipeter depuis le bord du puits pour éviter d’endommager le dôme du coloïde. Ajouter 300 μL de réactif de dissociation enzymatique dans chaque puits.Pour chaque puits, briser le dôme du coloïde en grattant la surface du puits avec la pointe d’une pipette P1000 et en pipetant la suspension cellulaire de haut en bas ; Essayez d’éviter de générer des bulles d’air. Recueillir la suspension cellulaire dans un tube de 15 ml.REMARQUE : Ce tube de 15 mL sera utilisé pour prélever des colonoïdes dans 10 puits de la plaque de 48 puits. Lavez le même puits avec un autre 200 μL du réactif de dissociation enzymatique pour vous assurer que tout le matériel colonoïde est recueilli et transféré dans le même tube de 15 mL. Répétez ce processus pour chaque puits de colonoïdes expansés récoltés et recueillez-les dans le même tube unique de 15 ml.REMARQUE : Pour une dissociation efficace, un maximum de 10 puits de colonoïdes doivent être collectés par tube. Si vous recueillez > 10 puits, répartissez également les colonoïdes collectés dans plusieurs tubes de 15 ml. Incuber le tube de 15 mL avec les coloïdes collectés à l’étape 2.5.2 dans un bain-marie à 37 °C pendant 5 min. Après l’incubation, centrifuger le tube pendant 3 min à 400 × g. Retirez délicatement le surnageant, en laissant environ 1,2 ml dans le tube.REMARQUE : L’étape suivante nécessite la dissociation physique des coloïdes à l’aide d’un pipetage rapide. Pour que cela soit efficace, vous devez avoir un petit volume de suspension cellulaire dans le tube – les 1,2 ml restants dans le tube de 15 ml sont suffisants à cet effet. Remettre en suspension la pastille coloïde dans les 1,2 mL restants du réactif de dissociation enzymatique. À l’aide d’une pipette P1000 réglée à 1 000 μL, placez la pointe de la pipette dans la suspension, en la tenant juste au-dessus du fond du tube de 15 mL, puis pipetez rapidement la suspension à l’intérieur et à l’extérieur de la pointe. Pour pipeter rapidement, appuyez rapidement sur le bouton du piston jusqu’à la première butée, relâchez le bouton jusqu’à ce qu’il soit à peu près à mi-chemin de la position haute, et répétez l’opération. Pipeter rapidement pendant environ 10 s (30 à 40 dépressions), puis remettre la suspension en suspension complètement et répéter le pipetage. Effectuez 2 à 3 cycles de pipetage rapide. Vérifiez l’échantillon au microscope pour confirmer qu’il ne reste plus de colonoïdes entiers et que la majorité des fragments de colonoïdes mesurent environ 30 à 40 m (figure 1Bii). Si l’échantillon nécessite une dissociation supplémentaire, incuber dans le bain-marie à 37 °C pendant 3 minutes supplémentaires, répéter la technique de pipetage à l’étape 2.7 et vérifier l’échantillon au microscope. Répétez ce processus jusqu’à ce que la majorité des fragments de coloïde soient de la taille optimale.REMARQUE : Veillez à ne pas trop dissocier les colonoïdes car cela entraînerait une mort cellulaire excessive, une faible efficacité de placage et des colonoïdes sous-dimensionnés. Ajouter 10 ml de produit de lavage organoïde glacé (tableau 1) dans le tube de 15 ml. Centrifuger le tube pendant 3 minutes à 400 × g, retirer le surnageant, le remettre en suspension dans 1 mL de produit de lavage organoïde glacé et le transférer dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL (appelé tube à fragments de coloïde). Mélanger le contenu du tube de fragment de coloïde par pipetage et prélever un échantillon de 50 μL ; transférer cet échantillon de 50 μL dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 mL (appelé tube de comptage cellulaire). Rangez le tube de fragment de coloïde sur de la glace à partir de ce point jusqu’à la fin de l’étape 2.15. Centrifuger le tube de numération cellulaire pendant 3 minutes à 400 × g, retirer le surnageant et remettre en suspension dans 500 μL de réactif de dissociation enzymatique complété par 10 μM de l’inhibiteur ROCK-I/II Y-27632. Incuber le tube de numération cellulaire unique dans le bain-marie à 37 °C pendant 5 min. À l’aide d’une pipette P1000 réglée à 400 μL, pipetez l’échantillon comme décrit à l’étape 2.7 et vérifiez l’échantillon au microscope pour vous assurer qu’il y a une suspension unicellulaire. Si ce n’est pas le cas, répétez ce processus jusqu’à ce que les colonoïdes soient complètement dissociés en une suspension unicellulaire. Ajouter 1 mL de produit de lavage organoïde dans le tube de numération unicellulaire, centrifuger pendant 3 minutes à 400 × g et retirer délicatement le surnageant. Remettre les cellules en suspension dans 50 μL de milieu de lavage organoïde, puis ajouter 50 μL de bleu trypan. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Calculez le nombre de cellules dans l’échantillon de 50 μL et utilisez-le pour calculer la concentration de cellules dans le tube de fragment de coloïde. Calculez le volume de suspension cellulaire requis pour l’expérience où 0,5 × 104 cellules coloïdes seront ensemencées par puits d’une plaque de microtitration de 96 puits. Ajoutez environ 15 % supplémentaires à ce volume calculé pour tenir compte du volume mort. Transférez ce volume total du tube à fragments de coloïde (étape 2.11) dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 ml.Centrifuger le nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 mL contenant des fragments de coloïde pendant 3 min à 400 × g, retirer le surnageant et remettre en suspension dans l’EMB (utiliser 10 μL d’EMB par 0,5 × 104 cellules).REMARQUE : En raison des caractéristiques physiques du BME (viscosité élevée, polymérisation dépendante de la température), une quantité importante de matériau peut être perdue par pipetage (volume mort). Installez le tube ou le réservoir contenant la suspension de colonoïdes/BME sur de la glace dans un récipient stérile à l’intérieur de l’enceinte de sécurité biologique.REMARQUE : Le fait de garder les cellules sur de la glace pendant l’ensemencement empêche le substrat cellulaire de polymériser prématurément. À l’aide d’une plaque de microtitration préincubée de 96 puits (à partir de l’étape 2.3), pipette inversée de 10 μL de la solution de coloïde/BME par puits. Assurez-vous de positionner la pointe juste au-dessus de la surface du puits et pipetez au centre pour éviter de heurter la paroi du puits. Mélangez régulièrement la suspension de colonoïde/BME pour éviter un ensemencement inégal.REMARQUE : Ne semez pas de colonoïdes dans les puits du bord extérieur de la plaque de microtitration.Pour inverser la pipette :Réglez la pipette, puis appuyez sur le bouton du piston après la première butée jusqu’à la deuxième butée. En maintenant cette position, plongez l’embout dans la suspension coloïde/BME et relâchez lentement le piston vers le haut. Distribuez la suspension en appuyant doucement et régulièrement sur le bouton du piston jusqu’à la première butée. Si vous ensemencez plus de puits, maintenez cette position et répétez les étapes 2.18.1.2 à 2.18.1.3. Une fois terminé, expulsez la petite quantité de suspension restante en appuyant sur le bouton piston jusqu’à la deuxième butée.REMARQUE : Nous recommandons d’utiliser la technique de pipetage inverse en raison de la viscosité élevée du BME. Retournez la plaque en douceur et régulièrement et incubez à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 20 min. Retirez la plaque de l’incubateur. Assurez-vous que le BME est entièrement polymérisé, puis superposez les dômes avec 200 μL de milieu de prolifération organoïde préchauffé. Si vous utilisez une plaque de microtitration de 96 puits avec un fossé environnant (qui réduit l’évaporation), remplissez chaque réservoir avec 2 ml de produit de lavage organoïde. Incuber les colonoïdes à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 3 jours et inspecter au microscope une fois par jour pour s’assurer que les colonoïdes se sont rétablis et prolifèrent. 3. Traitements des coloïdes pour le test de mort cellulaire Préparez une solution de 2,5 μM de colorant fluorescent pour la mort cellulaire (SYTOX Green Nucleic Acid Stain) et de solution de DMSO en ajoutant un colorant fluorescent pour la mort cellulaire ou du DMSO dans un milieu de prolifération organoïde préchauffé (tableau 2).REMARQUE : Protégez le stock de colorant de mort cellulaire fluorescente et la solution diluée de la lumière. La coloration d’acide nucléique vert SYTOX est solubilisée dans le DMSO ; la solution de DMSO est utilisée pour préparer la condition sans colorant afin de contrôler les effets des solvants. Utilisez la solution de 2,5 μM de colorant fluorescent pour la mort cellulaire et la solution de DMSO de l’étape 3.1 pour préparer les traitements comme indiqué dans le tableau 2. Retirer délicatement le milieu de la plaque de microtitration de 96 puits ensemencée de colonoïdes en inclinant la plaque et en pipetant à partir du bord des puits ; ajoutez ensuite 200 μL de milieu de traitement par puits. Assurez-vous d’avoir des puits de contrôle PBS/BSA supplémentaires pour la ou les conditions de toxicité maximale (voir le tableau 2 pour la carte des plaques). Incuber les coloïdes à 37 °C, 5 % de CO2 pendant les points de traitement requis jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour l’imagerie. Au moins 2 h avant l’imagerie, préparer une solution à 10 % v/v de Triton-X 100 dans de l’eau stérile de culture cellulaire et ajouter 22 μL de Triton-X 100 à 10 % directement dans le milieu des puits témoins pour la ou les conditions de toxicité maximale jusqu’à une concentration finale de 1 % v/v 1 h avant l’imagerie.REMARQUE : L’utilisation d’une solution à 10% réduit les erreurs de pipetage qui peuvent se produire en raison de la viscosité élevée du tensioactif. 4. Acquisition d’images Retirer de l’incubateur la plaque de microtitration à 96 puits ensemencée de colonoïdes et la transférer sur la platine d’un microscope numérique à épifluorescence inversée. Laissez la plaque revenir à température ambiante. Confirmez que les colonoïdes de la condition de toxicité maximale sont complètement lysés en les examinant au microscope (Figure 1Biii). Sélectionnez un objectif approprié, tel qu’un objectif à fluorescence 40x à longue distance de travail. Optimisez les paramètres d’imagerie du microscope avant de commencer.En utilisant le canal de transmission, concentrez-vous sur un colonoïde avec des cellules positives à SYTOX, passez à la protéine fluorescente verte (GFP)(488 nm) et ajustez l’intensité lumineuse et le temps d’exposition pour maximiser le signal fluorescent tout en minimisant l’arrière-plan. Essayez d’abord une faible intensité lumineuse, puis augmentez progressivement le temps d’exposition ; Si la durée d’exposition n’est pas pratique, augmentez légèrement l’intensité lumineuse.REMARQUE : L’augmentation du temps d’exposition au lieu de l’intensité lumineuse réduira la phototoxicité et le photoblanchiment des échantillons19. N’exposez les échantillons à la lumière fluorescente que lorsque cela est nécessaire. À l’aide des paramètres d’imagerie optimisés pour le canal GFP, observez les conditions No Dye et Max Toxicity pour vous assurer que les échantillons ne sont pas surexposés ou sous-exposés. Une fois finalisé, gardez les paramètres d’imagerie cohérents entre les conditions. Acquérez des images à l’aide d’une approche d’échantillonnage aléatoire : pour ce faire, sélectionnez des champs de vision (FOV) qui suivent un motif de grille fixe qui recouvre le dôme du coloïde. Acquérir des images de colonoïdes à partir d’un minimum de 10 FOV. Assurez-vous que le plan central du colonoïde est net et acquérez des images dans les canaux de transmission et GFP.Appliquez les critères d’exclusion suivants.N’acquérez pas d’images s’il n’y a pas de colonoïdes présents dans le FOV. N’acquérez pas d’images s’il n’y a que des colonoïdes qui se chevauchent dans le même plan focal présent dans le champ de vision (Figure 1Biv). N’acquérez pas d’images s’il n’y a que des débris de coloïdes présents dans le champ de vision (Figure 1Bv). N’incluez pas de débris de coloïdes dans l’analyse. Enregistrez les images au format graphique du réseau portable et exportez-les. Si vous imagez des points temporels supplémentaires, remettez la plaque de microtitration à 96 puits avec des coloïdes dans l’incubateur à 37 °C, 5 % de CO2. 5. Analyse d’images Ouvrez Fiji ImageJ et importez le jeu de données d’images en faisant glisser et en déposant les fichiers sur la barre d’outils ImageJ ou en accédant à Fichier | Ouvrez et sélectionnez les fichiers. Une fois ouvert, combinez les fichiers dans une pile d’images en cliquant sur Image| Piles| Images à empiler. Convertissez la pile d’images au format de fichier 8 bits en cliquant sur Image| Type| 8 bits. Pour chaque visionneuse d’images, cliquez sur l’outil Sélections à main levée dans la barre d’outils ImageJ et sélectionnez manuellement la région d’intérêt (ROI) sur l’image de transmission à l’aide de la souris de l’ordinateur. le ROI est le périmètre du colonoïde. Ensuite, basculez dans la pile d’images jusqu’à l’image du canal GFP correspondant. Cliquez sur Analyser| Définir les mesures ; dans la boîte de dialogue Définir les mesures , cochez la case Valeur moyenne de gris et ne cochez pas toutes les autres cases. Une fois l’image GFP sélectionnée, cliquez sur Analyser | Mesurer. Répétez cette analyse pour chaque colonoïde de la pile d’images. Une fois l’ensemble de données analysé, copiez toutes les données dans la fenêtre Résultats et collez-les dans une application logicielle de tableur. 6. Calcul du % de toxicité maximale Calculer la moyenne des valeurs moyennes de gris (MGV) répliquées techniques pour chaque condition à l’aide de l’équation (1). (moyenne du traitement a) = (1) Exprimer la moyenne de chaque condition en pourcentage par rapport à la moyenne de la condition de toxicité maximale (MT) à l’aide de l’équation (2).%MTa = (2) 7. Calcul de l’IPC Normaliser (NORM) les données comme suit, à l’aide des valeurs moyennes calculées à l’étape 6.1, soustraire la moyenne de l’état non traité (UT) de chaque condition de traitement et de la condition de toxicité maximale (MT) (pour éliminer la mort cellulaire de fond qui se produit indépendamment du traitement par cytokines). Ensuite, divisez chaque condition de traitement par la moyenne soustraite du bruit de fond de la condition de toxicité maximale (MT), comme indiqué dans l’équation (3).NORMEa = (3) Soustraire de 1 les valeurs normalisées calculées à l’étape 7.1 ; les valeurs résultantes représentent la viabilité cellulaire (V) après traitement (comme dans l’équation (4) ci-dessous).Va = 1 −NORMa (4) Calculer le coefficient d’interaction des perturbagènes (IPC) à l’aide de l’équation (5) :IPC = (5)où a désigne le premier traitement ; b désigne le deuxième traitement ; Et l’AB est le traitement combiné. Les valeurs de l’IPC indiquent des relations synergiques (1).