生蛍光顕微鏡を用いたヒト結腸オルガノイドにおけるサイトカイン誘発性細胞死の定量化(英語)

結腸粘膜生検は、標準治療の一環として定期的な大腸内視鏡検査を受けているCD患者から採取されました。患者組織サンプルの使用とこれらのサンプルからの結腸オルガノイドラインの生成に関する倫理的承認は、コーク教育病院の臨床研究倫理委員会(CREC)から取得されました。書面によるインフォームドコンセントは、ヘルシンキ宣言に同意してすべての患者から得られました。患者の生検とコロノイドを伴うすべての組織培養作業は、BSL2安全プロトコルに従ってバイオセーフティキャビネット内で行う必要があります。使用する前に、すべてのプラスチック摩耗が滅菌されていることを確認してください。このプロトコールで使用されるすべての材料、試薬、機器、およびソフトウェアに関連する詳細については、 材料表 を参照してください。 私たちのグループが陰窩単離とオルガノイド培養に使用するプロトコルは、確立された方法14,15,16から適応され、以前に発表されました9,10,17。以下のプロトコルでは、オルガノイド増殖培地を使用してコロノイドを培養しました(表1)。オルガノイド増殖培地を使用して増殖したコロノイドは未分化であり、結腸幹細胞に濃縮されています。オルガノイド増殖培地の主成分は、腸管幹細胞ニッチ成長因子Wnt-3A(W)、R-spondin 3(R)、およびNoggin(N)15を含む50%L-WRNコンディショニング培地です。オルガノイド増殖培地は、L-WRN馴化培地と無血清培地を1:1で組み合わせ、その後ニコチンアミドと化学阻害剤を補給することで調製します(表1)。 1.結腸陰窩の分離とコロノイド培養 48ウェルマイクロタイタープレートを37°C、5%CO2 で最低72時間プレイインキュベートしてから、陰窩で播種します。注:プレートを事前にインキュベートすると、播種中の基底膜抽出物(BME)の重合が促進されます。 地下室の分離の前夜に、BMEを4°Cの氷上で解凍します。 結腸生検を15 mLの生検採取培地(表1)が入ったサンプル採取チューブに集め、処理の準備ができるまで4°Cで保存します。 ピペットを使用して、できるだけ多くの生検採取培地を慎重に取り出します。2.5 μg/mL のアムホテリシン B と 100 μg/mL のゲンタマイシンを添加した氷冷 DPBS 15 mL をサンプルチューブに追加して、生検を洗浄します。サンプルチューブを激しく振って、生検から粘液や破片を解離させます。生検を重力で落ち着かせ、ピペットを使用してできるだけ多くのDPBSを慎重に除去します。ステップ1.4の洗浄手順を2回(2回)繰り返します。 2.5 μg/mL のアムホテリシン B と 200 μg/mL のゲンタマイシンを添加した 10 mL の酵素フリー細胞解離試薬をサンプルチューブに加え、室温で 15 分間インキュベートし、30 rpm でロッキングします。 インキュベーション後、サンプルチューブを手で左右に激しく振って、結腸陰窩を解放します。低倍率の光学顕微鏡を使用してチューブを検査し、放出された陰窩と懸濁中の陰窩の断片を探します。見えない場合は、チューブを振って再度確認してください。陰窩が吊り下げられているのが見えるまで繰り返します。 70 μmのセルストレーナを50 mLのチューブに取り付け、クリプト懸濁液をストレーナーでろ過します。氷冷したオルガノイド洗浄培地10 mL(表1)を空のサンプルチューブに加え、培地を取り出して細胞ストレーナーに通します。 ろ過した陰窩を2本の15 mLチューブ(チューブあたり10 mL)に移し、4°Cで150 × gで5分間遠心分離します。 各15 mLチューブから上清を慎重に取り除き、クリプトペレットを500 μLの氷冷オルガノイド洗浄培地に再懸濁し、両方の15 mLチューブからクリプト溶液を1本の1.5 mLマイクロ遠心チューブに移し、4°Cで400 × gで3分間遠心分離します。 微量遠心チューブから上清を慎重に取り除き、クリプトペレットを70 μLのBME(ウェルあたり20 μL、10 μLの追加デッドボリューム)に再懸濁します。 インキュベート済みの48ウェルプレート(ステップ1.1)を使用して、20 μLのBME/クリプト懸濁液を各ウェルの中央に播種します(ウェルあたり1つのBMEドーム)。プレートをスムーズかつ着実に反転させ、37°C、5%CO2 で20分間インキュベートします。注:プレートを反転させることで、細胞がウェルのプラスチック表面に付着するのを防ぎ、BME内での細胞の分布を確保します。 インキュベーターからプレートを取り外します。BMEが完全に重合したことを確認してから、350 μLの予熱したオルガノイド増殖培地に100 μg/mLの広範囲の抗菌試薬を添加してドームをオーバーレイします。プレートを37°C、5%CO2でインキュベートします。注:広範囲の抗菌試薬は、結腸生検に関連する粘膜微生物からの汚染を防ぐためのものです。これは、陰窩の分離後の培養の最初の週にのみ必要です。 培地を1週間に2〜3回交換し、温めたオルガノイド増殖培地を使用し、培養の最初の1週間は広範囲の抗菌試薬を補充します。この期間が経過したら、試薬を取り出します。 コロノイド培養が完全に確立されたら(単離後1〜2週間)、10 μMのROCK-I/II阻害剤Y-27632を添加した酵素解離試薬を使用してコロノイドを解離します(コロノイド解離の詳細についてはセクション2を参照)。注:最初の2つのパッセージ(P0-1、P1-2)では、コロノイドは1:1/2の比率を使用して拡張する必要があります。P2の後、コロノイドは1:3/4の比率を使用して継代することができます。 手順1.11-1.13に従ってコロノイドを播種し、維持します(オルガノイド増殖培地に広範囲の抗菌試薬を添加しないでください)。 2. 細胞死アッセイのための大腸系化合物の調製 注:細胞死アッセイプロトコルは、完了するまでに4日かかります(図1A)。 48ウェルプレートフォーマットを使用してコロノイドを拡大し、ウェルあたり20μLのBME/陰窩懸濁液を播種し、37°C、5%CO2でインキュベートし、培地を週に2〜3回(ウェルあたり350μL)交換します。 細胞死アッセイのために、回収の約1週間前に結腸を通過させます。コロノイドを回収する前に、コロノイドが高密度に増殖していること(図1Bi)、直径が約25〜50μmであること、および活発に増殖していることを確認してください。注:このアッセイには、継代3から継代14までコロノイドを使用し、一貫した結果が得られました。しかし、サイトカインに対するコロノイドの転写応答は、培養期間によって変化する可能性があることが実証されています18。これに基づいて、15番通過後、このアッセイにはコロンイドを使用しないことをお勧めします。 96ウェルマイクロタイタープレートを37°C、5%CO2 で最低72時間プレイインキュベートしてから、コロノイド細胞を播種します。 実験開始の前夜に、BMEを氷上で4°Cで解凍します。 十分な量の酵素解離試薬(コロノイドのウェルあたり500 μL)を調製し、10 μMのROCK-I/II阻害剤Y-27632を補給します。コロノイドを含むウェルから培地を静かに取り出します。コロノイドドームの損傷を避けるために、井戸の端からピペットで動かします。各ウェルに300 μLの酵素解離試薬を添加します。ウェルごとに、P1000ピペットの先端でウェルの表面をこすり、細胞懸濁液を上下にピペッティングして、コロノイドドームを分解します。気泡が発生しないようにしてください。細胞懸濁液を15mLのチューブに集めます。注:この15mLチューブは、48ウェルプレートの10ウェルからコロノイドを収集するために使用されます。 同じウェルを別の200 μLの酵素解離試薬で洗浄し、すべてのコロノイド材料が収集され、同じ15 mLチューブに移されることを確認します。このプロセスを、回収する拡張コロノイドの各ウェルに対して繰り返し、それらを同じ単一の15 mLチューブに回収します。注:効率的な解離のために、チューブごとに最大10ウェルのコロノイドを収集する必要があります。>10ウェルを採取する場合は、採取したコロノイドを複数の15mLチューブに均等に分割します。 ステップ 2.5.2 で採取したコロノイドを含む 15 mL チューブを、37 °C の水浴で 5 分間インキュベートします。インキュベーション後、チューブを400 × gで3分間遠心分離します。上清を静かに取り除き、チューブ内に約1.2 mLを残します。注:次のステップでは、迅速なピペッティングを使用してコロノイドを物理的に解離する必要があります。これを効果的に行うには、チューブ内に少量の細胞懸濁液が必要です – この目的には、15mLのチューブに残っている1.2mLで十分です。 コロノイドペレットを残りの1.2 mLの酵素解離試薬に再懸濁します。1,000 μLに設定したP1000ピペットを使用して、ピペットの先端を懸濁液に入れ、15 mLチューブの底のすぐ上に保持してから、懸濁液をチップにすばやく出し入れします。すばやくピペットで移動するには、プランジャーボタンを最初のストップまですばやく押し、ボタンが上位置の約半分になるまでボタンを離して、繰り返します。約10秒間(30〜40回の窪み)迅速にピペットで移動し、懸濁液を完全に再懸濁してピペッティングを繰り返します。2〜3ラウンドのラピッドピペッティングを行います。 顕微鏡でサンプルをチェックし、コロノイド全体が残っていないこと、およびコロノイドフラグメントの大部分のサイズが約30〜40μmであることを確認します(図1Bii)。 サンプルをさらに解離する必要がある場合は、37°Cのウォーターバスでさらに3分間インキュベートし、ステップ2.7のピペッティング技術を繰り返して、顕微鏡でサンプルを確認します。コロノイドフラグメントの大部分が最適なサイズになるまで、このプロセスを繰り返します。注:コロノイドを解離しすぎると、過剰な細胞死、低いめっき効率、および小さすぎるコロノイドにつながるため、注意してください。 10 mLの氷冷オルガノイド洗浄培地(表1)を15 mLチューブに加えます。チューブを400 × gで3分間遠心分離し、上清を取り除き、氷冷したオルガノイド洗浄培地1 mLに再懸濁し、1.5 mLの微量遠心チューブ( コロノイドフラグメントチューブと呼ばれる)に移します。 ピペッティングで コロノイドフラグメントチューブ の内容物を混合し、50 μLのサンプルを採取します。この50 μLサンプルを新しい1.5 mL微量遠心チューブ( セルカウントチューブと呼びます)に移します。この時点からステップ2.15の完了まで、 コロノイドフラグメントチューブ を氷上に保管します。 細胞カウントチューブを400 × gで3分間遠心分離し、上清を除去し、10 μMのROCK-I/II阻害剤Y-27632を添加した500 μLの酵素解離試薬に再懸濁します。 シングル セルカウントチューブ をウォーターバス中で37°Cで5分間インキュベートします。400 μLに設定したP1000ピペットを使用して、ステップ2.7の説明に従ってサンプルをピペットで移動し、顕微鏡でサンプルをチェックして、単一細胞懸濁液があることを確認します。そうでない場合は、コロノイドが単一細胞懸濁液に完全に解離するまで、このプロセスを繰り返します。 1 mLのオルガノイド洗浄培地をシングル セルカウントチューブに加え、400 × g で3分間遠心分離し、上清を慎重に取り除きます。細胞を50 μLのオルガノイド洗浄培地に再懸濁し、次に50 μLのトリパンブルーを加えます。 血球計算盤を使用して細胞をカウントします。50 μL サンプル中の細胞数を計算し、これを使用して コロノイドフラグメントチューブ内の細胞濃度を計算します。 96ウェルマイクロタイタープレートのウェルごとに0.5×10個の4コロイド細胞を播種する実験に必要な細胞懸濁液の量を計算します。この計算されたボリュームに約15%の追加で、デッドボリュームを考慮します。この総量を コロノイドフラグメントチューブ (ステップ2.11)から新しい1.5 mL微量遠心チューブに移します。コロノイドフラグメントを含む新しい1.5 mL微量遠心チューブを400 × gで3分間遠心分離し、上清を除去し、BMEに再懸濁します(0.5 × 104細胞あたり10 μLのBMEを使用します)。注:BME(高粘度、温度依存性重合)の物理的特性により、ピペッティング(デッドボリューム)によってかなりの量の材料が失われる可能性があります。 氷上にコロノイド/BME懸濁液を含むチューブまたはリザーバーをバイオセーフティキャビネット内の滅菌容器に設置します。注:播種中に細胞を氷上に保つことで、細胞基質が早期に重合するのを防ぐことができます。 インキュベート済みの96ウェルマイクロタイタープレート(ステップ2.3から)を使用して、1ウェルあたり10 μLのコロノイド/BME溶液をリバースピペットで分注します。ウェルの壁にぶつからないように、チップをウェルの表面のすぐ上に配置し、ピペットで中央にピペットで固定してください。コロノイド/ BME懸濁液を定期的に混合して、不均一な播種を防ぎます。注:マイクロタイタープレートの外縁ウェルにコロノイドを播種しないでください。リバースピペットを打つには:ピペットをセットし、プランジャーボタンを押して最初のストップを過ぎて2番目のストップまで押します。 この位置を保持したまま、先端をコロンイド/ BME懸濁液に浸し、プランジャーをゆっくりと上部に放します。 プランジャーボタンを静かに着実に押して最初の停止までサスペンションを分配します。より多くのウェルを播種する場合は、この位置を保持して、手順2.18.1.2-2.18.1.3を繰り返します。 終了したら、プランジャーボタンを押して2番目のストップまで押して、わずかに残ったサスペンションを排出します。注:BMEの粘度が高いため、リバースピペッティング技術の使用をお勧めします。 プレートをスムーズかつ着実に反転させ、37°C、5%CO2 で20分間インキュベートします。 インキュベーターからプレートを取り外します。BMEが完全に重合したことを確認してから、200 μLの予熱したオルガノイド増殖培地をドームに重ねます。周囲の堀(蒸発を抑える)を備えた96ウェルマイクロタイタープレートを使用する場合は、各リザーバーに2 mLのオルガノイド洗浄培地を満たします。 コロノイドを37°C、5%CO2 で3日間インキュベートし、1日1回顕微鏡で検査して、コロノイドが回復して増殖していることを確認します。 3. 細胞死アッセイのためのコロノイド治療 蛍光細胞死色素(SYTOX Green Nucleic Acid Stain)とDMSO溶液の2.5 μM溶液を調製し、予熱したオルガノイド増殖培地に蛍光細胞死色素またはDMSOを添加します(表2)。注:蛍光細胞死色素ストックおよび希釈溶液を光から保護してください。SYTOX Green Nucleic Acid StainはDMSOに可溶化されます。DMSO溶液は、溶媒の影響を制御するための染料なし条件を準備するために使用されます。 表 2に示すように、ステップ3.1の蛍光細胞死色素とDMSO溶液の2.5μM溶液を使用して、治療を調製します。 コロノイドを播種した96ウェルマイクロタイタープレートから培地を静かに取り出します。プレートを傾けてウェルの端からピペッティングします。次に、ウェルあたり200μLの処理培地を添加します。最大毒性条件に対して、追加のPBS/BSAコントロールウェルを必ず用意してください(プレートマップの 表2を参照)。 イメージングの準備が整うまで、コロノイドを37°C、5%CO2 で必要な処理時間だけインキュベートします。 イメージングの少なくとも2時間前に、Triton-X 100の10%v/v溶液を滅菌細胞培養グレードの水で調製し、イメージング前に22μLの10%Triton-X 100をコントロールウェルの培地に直接加え、最大毒性条件で最終濃度1% v/v 1時間にします。注:10%溶液を使用すると、界面活性剤の高粘度によるピペッティングエラーが減少します。 4. 画像取得 コロノイドを播種した96ウェルマイクロタイタープレートをインキュベーターから取り出し、デジタル倒立脱蛍光顕微鏡のステージに移します。プレートを室温に戻します。 顕微鏡で調べて、Max Toxicity状態のコロノイドが完全に溶解していることを確認します(図1Biii)。 長作動距離の40倍蛍光対物レンズなど、適切な対物レンズを選択します。始める前に、顕微鏡のイメージング設定を最適化してください。伝達チャネルを使用して、SYTOX陽性細胞を持つコロノイドに焦点を当て、緑色蛍光タンパク質(GFP)に切り替えますチャネル(488 nm)で、光の強度と露光時間を調整して、バックグラウンドを最小限に抑えながら蛍光シグナルを最大化します。まず、光の強度を低くしてから、露光時間を徐々に増やします。露光時間が実用的でない場合は、光の強度を少し上げます。注:光強度の代わりに露光時間を長くすると、サンプルの光毒性と光退色が減少します19。サンプルを蛍光灯にさらすのは、必要なときだけにしてください。 GFPチャンネルに最適化されたイメージング設定を使用して、No DyeおよびMax Toxicityの条件を観察し、サンプルが過剰または過小に露光されていないことを確認します。確定したら、条件間でイメージング設定を一定に保ちます。 ランダムサンプリングアプローチを使用して画像を取得する:これを行うには、コロノイドドームを覆う固定グリッドパターンに従う視野(FOV)を選択します。最小 10 個の FOV からコロンイドの画像を取得します。コロノイドの中心面にピントが合っていることを確認し、透過チャネルとGFPチャネルの両方で画像を取得します。次の除外条件を適用します。FOVにコロンイドが存在しない場合は、画像を取得しないでください。 FOVに存在する同じ焦点面に重なり合っているコロンイドのみがある場合は、画像を取得しないでください(図1、Biv)。 FOVにコロノイドの破片しかない場合は、画像を取得しないでください(図1Bv)。コロノイドの破片を解析に含めないでください。 画像をポータブルネットワークグラフィック形式で保存し、エクスポートします。 追加のタイムポイントをイメージングする場合は、コロノイドを添加した96ウェルマイクロタイタープレートを37°C、5%CO2のインキュベーターに戻します。 5. 画像解析 Fiji ImageJを開き、ファイルをImageJツールバーにドラッグアンドドロップするか、[ ファイル]|ファイルを開いて 選択します。開いたら、画像 |スタック|スタックする画像。画像スタックを8ビットファイル形式に変換するには、[ 画像]|タイプ|8 ビット。 画像セットごとに、ImageJ ツールバーの [フリーハンド選択 ] ツールをクリックし、コンピューターのマウスを使用して伝送画像の関心領域 (ROI) を手動で選択します。ROIはコロノイドの周囲長です。次に、画像スタックを対応するGFPチャネル画像に切り替えます。 [分析] |測定値を設定します。[Set Measurements]ダイアログウィンドウで、[Mean Grey Value]にチェックマークを付け、他のすべてのボックスはオフのままにします。GFP 画像を選択した状態で、[分析] |測定します。イメージ スタック内のすべてのコロノイドに対して、この分析を繰り返します。データセットが分析されたら、[結果] ウィンドウのすべてのデータをコピーして、スプレッドシート ソフトウェア アプリケーションに貼り付けます。 6.最大毒性の%計算 式 (1) を使用して、各条件のテクニカル レプリケート平均グレー値 (MGV) の平均を計算します。 (治療平均A)= (1) 式 (2) を使用して、各条件の平均を Max Toxicity 条件 (MT) の平均に対するパーセンテージで表します。%MTa = (2) 7. 消費者物価指数の算出 ステップ6.1で計算した平均値を用いて、各治療条件から未治療状態(UT)と最大毒性(MT)条件の平均を差し引く(サイトカイン処理とは無関係に発生するバックグラウンド細胞死を除去するため)ことにより、以下のようにデータを正規化(NORM)します。次に、式(3)に示すように、各治療条件を最大毒性(MT)条件のバックグラウンド減算平均で除算します。ノルムa = (3) ステップ 7.1 で計算した正規化値を 1 から減算します。結果の値は、処理後の細胞生存率(V)を表します(以下の式(4)を参照)。Va = 1 −NORMa (4) 式 (5) を使用して摂動相互作用係数 (CPI) を計算します。CPI= (5)ここで、aは最初の治療を示します。b は 2 番目の処理を示します。そしてABは併用療法です。CPI値は、相乗的(1)の関係を示します。