Quantificazione della morte cellulare indotta da citochine in organoidi del colon umano mediante microscopia a fluorescenza dal vivo

Le biopsie della mucosa del colon sono state raccolte da pazienti con MC sottoposti a colonscopia di routine come parte dello standard di cura. L’approvazione etica per l’uso di campioni di tessuto dei pazienti e la generazione di linee di organoidi del colon da questi campioni è stata ottenuta dal Comitato Etico per la Ricerca Clinica degli Ospedali Universitari di Cork (CREC). Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i pazienti in accordo con la Dichiarazione di Helsinki. Tutto il lavoro di coltura tissutale con biopsie e colonoidi del paziente deve essere eseguito all’interno di una cabina di biosicurezza seguendo i protocolli di sicurezza BSL2. Assicurarsi che tutta l’usura della plastica sia sterile prima dell’uso. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, i reagenti, gli strumenti e il software utilizzati in questo protocollo. I protocolli utilizzati dal nostro gruppo per l’isolamento delle cripte e la coltura di organoidi sono stati adattati dai metodi stabiliti 14,15,16 e sono stati pubblicati in precedenza 9,10,17. Per il seguente protocollo, i colonoidi sono stati coltivati utilizzando terreni di proliferazione degli organoidi (Tabella 1). I colonoidi coltivati utilizzando i terreni di proliferazione degli organoidi sono indifferenziati e arricchiti per le cellule staminali del colon. Il componente principale dei terreni di proliferazione degli organoidi è il 50% di terreno condizionato con L-WRN, che contiene i fattori di crescita della nicchia delle cellule staminali intestinali Wnt-3A (W), R-spondina 3 (R) e Noggin (N)15. I terreni di proliferazione degli organoidi vengono preparati combinando terreni condizionati con L-WRN e terreni privi di siero 1:1, seguiti da un’integrazione con nicotinamide e inibitori chimici (Tabella 1). 1. Isolamento delle cripte del colon e coltura colonoide Preincubare una piastra per microtitolazione a 48 pozzetti a 37 °C, 5% CO2 per un minimo di 72 ore prima di seminare con cripte.NOTA: La preincubazione della piastra accelera la polimerizzazione dell’estratto della membrana basale (BME) durante la semina. Scongelare il BME su ghiaccio a 4 °C la sera prima dell’isolamento delle cripte. Raccogliere le biopsie del colon in una provetta per la raccolta dei campioni contenente 15 mL di terreno per la raccolta delle biopsie (Tabella 1) e conservarle a 4 °C fino al momento dell’elaborazione. Rimuovere con cautela la maggior quantità possibile di terreno di raccolta per biopsia utilizzando una pipetta. Lavare le biopsie aggiungendo 15 mL di DPBS ghiacciato integrato con 2,5 μg/mL di amfotericina B e 100 μg/mL di gentamicina alla provetta del campione. Agitare energicamente la provetta del campione per dissociare il muco o i detriti dalle biopsie. Lasciare che le biopsie si depositino per gravità e rimuovere con cura quanto più DPBS possibile utilizzando una pipetta.Ripetere la procedura di lavaggio dal passaggio 1.4 due volte (2x). Aggiungere 10 mL di reagente di dissociazione cellulare privo di enzimi integrato con 2,5 μg/mL di amfotericina B e 200 μg/mL di gentamicina nella provetta del campione e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente con oscillazione a 30 giri/min. Dopo l’incubazione, agitare energicamente la provetta del campione da un lato all’altro per liberare le cripte del colon. Ispeziona il tubo usando un microscopio ottico a bassa potenza e cerca le cripte rilasciate e i frammenti di cripta in sospensione. Se non è visibile, agitare il tubo e ricontrollare; Ripeti fino a quando le cripte non si vedono in sospensione. Collegare un filtro cellulare da 70 μm a una provetta da 50 ml e filtrare la sospensione della cripta attraverso il filtro. Aggiungere 10 mL di Organoid Wash Media ghiacciato (Tabella 1) alla provetta vuota, rimuovere il terreno e passarlo attraverso il filtro cellulare. Trasferire le cripte filtrate in due provette da 15 mL (10 mL per provetta) e centrifugare a 4 °C per 5 min a 150 × g. Rimuovere con cura il surnatante da ciascuna provetta da 15 mL, risospendere i pellet di cripta in 500 μL di Organoid Wash Media ghiacciato, trasferire la soluzione crypt da entrambe le provette da 15 mL a una singola provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e centrifugare a 4 °C per 3 min a 400 × g. Rimuovere con cautela il surnatante dalla provetta per microcentrifuga e risospendere il pellet della cripta in 70 μL di BME (20 μL per pozzetto e 10 μL di volume morto extra). Utilizzando la piastra preincubata a 48 pozzetti (passaggio 1.1), seminare 20 μL di sospensione BME/cripta al centro di ciascun pozzetto (1 cupola BME per pozzetto). Capovolgere la piastra in modo uniforme e costante e incubare a 37 °C, 5% CO2 per 20 minuti.NOTA: L’inversione della piastra impedisce alle cellule di aderire alla superficie plastica del pozzetto e ne garantisce la distribuzione all’interno del BME. Rimuovere la piastra dall’incubatrice. Assicurarsi che il BME sia completamente polimerizzato e quindi sovrapporre le cupole con 350 μL di terreno di proliferazione degli organoidi preriscaldato integrato con 100 μg/mL di un reagente antimicrobico ad ampio spettro. Incubare la piastra a 37 °C, 5% CO2.NOTA: Il reagente antimicrobico ad ampio raggio serve a prevenire la contaminazione da microbi della mucosa associati alle biopsie del colon. È richiesto solo per la prima settimana di coltura dopo l’isolamento della cripta. Cambiare il terreno 2-3 volte in una settimana utilizzando terreni di proliferazione di organoidi preriscaldati, integrandoli con il reagente antimicrobico ad ampio spettro per la prima settimana di coltura; Trascorso questo periodo, rimuovere il reagente. Una volta che la coltura colonoide è completamente stabilita (1-2 settimane dopo l’isolamento), dissociare i colonoidi utilizzando il reagente di dissociazione enzimatica integrato con 10 μM dell’inibitore ROCK-I/II Y-27632 (vedere la sezione 2 per tutti i dettagli sulla dissociazione colonoide).NOTA: Per i primi due passaggi (P0-1, P1-2), i colonoidi devono essere espansi utilizzando un rapporto 1:1/2; dopo P2, i colonoidi possono essere fatti passare utilizzando un rapporto 1:3/4. Seminare e mantenere i colonoidi seguendo i passaggi 1.11-1.13 (non integrare i terreni di proliferazione degli organoidi con il reagente antimicrobico ad ampio raggio). 2. Preparazione di colonoidi per il saggio di morte cellulare NOTA: Il protocollo del test di morte cellulare richiede 4 giorni per essere completato (Figura 1A). Espandere i colonoidi utilizzando un formato di piastra a 48 pozzetti, seminando 20 μL di sospensione BME/cripta per pozzetto, incubando a 37 °C, 5% CO2 e cambiando il terreno 2-3 volte a settimana (350 μL per pozzetto). Passaggio dei colonoidi circa 1 settimana prima del prelievo per il test di morte cellulare. Prima di raccogliere i colonoidi, assicurarsi che siano propagati ad alta densità (Figura 1Bi), che abbiano un diametro di circa 25-50 μm e che stiano proliferando attivamente.NOTA: Abbiamo utilizzato i colonoidi per questo test dal passaggio 3 al passaggio 14 con risultati coerenti. Tuttavia, è stato dimostrato che la risposta trascrizionale dei colonoidi alle citochine può cambiare a seconda della durata della coltura18. Su questa base, si consiglia di non utilizzare colonoidi per questo test dopo il passaggio 15. Preincubare piastre per microtitolazione a 96 pozzetti a 37 °C, 5% CO2 per un minimo di 72 ore prima della semina con cellule colonoidi. Scongelare il BME con ghiaccio a 4 °C la sera prima di iniziare l’esperimento. Preparare un volume sufficiente del reagente di dissociazione enzimatica (500 μL per pozzetto di colonoidi) integrando con 10 μM dell’inibitore ROCK-I/II Y-27632. Rimuovere delicatamente il terreno dai pozzetti contenenti colonoidi; pipetta dal bordo del pozzetto per evitare di danneggiare la cupola colonoide. Aggiungere 300 μl di reagente di dissociazione enzimatica a ciascun pozzetto.Per ogni pozzetto, rompere la cupola colonoide raschiando la superficie del pozzetto con la punta di una pipetta P1000 e pipettando la sospensione cellulare su e giù; Cerca di evitare di generare bolle d’aria. Raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da 15 mL.NOTA: Questa provetta da 15 mL verrà utilizzata per raccogliere i colonoidi da 10 pozzetti della piastra da 48 pozzetti. Lavare lo stesso pozzetto con altri 200 μl del reagente di dissociazione enzimatica per assicurarsi che tutto il materiale colonoide venga raccolto e trasferito nella stessa provetta da 15 mL. Ripetere questo processo per ogni pozzetto di colonoidi espansi che vengono raccolti e raccoglierli nella stessa singola provetta da 15 mL.NOTA: Per una dissociazione efficiente, è necessario raccogliere un massimo di 10 pozzetti di colonoidi per provetta. Se si raccolgono >10 pozzetti, dividere equamente i colonoidi raccolti su più provette da 15 ml. Incubare la provetta da 15 mL con i colonoidi raccolti dal passaggio 2.5.2 in un bagno d’acqua a 37 °C per 5 minuti. Dopo l’incubazione, centrifugare la provetta per 3 minuti a 400 × g. Rimuovere delicatamente il surnatante, lasciando circa 1,2 ml nella provetta.NOTA: La fase successiva richiede la dissociazione fisica dei colonoidi mediante pipettaggio rapido. Affinché ciò sia efficace, è necessario disporre di un piccolo volume di sospensione cellulare nella provetta: gli 1,2 mL rimasti nella provetta da 15 mL sono sufficienti a questo scopo. Risospendere il pellet colonoide nei restanti 1,2 mL del reagente di dissociazione enzimatica. Utilizzando una pipetta P1000 impostata su 1.000 μl, posizionare il puntale della pipetta nella sospensione, tenendolo appena sopra il fondo della provetta da 15 mL, quindi pipettare rapidamente la sospensione dentro e fuori dal puntale. Per pipettare rapidamente, premere rapidamente il pulsante dello stantuffo fino al primo arresto, rilasciare il pulsante fino a quando non si trova a circa metà della posizione superiore e ripetere. Pipettare rapidamente per circa 10 s (30-40 depressioni), quindi risospendere completamente la sospensione e ripetere il pipettaggio. Eseguire 2-3 cicli di pipettaggio rapido. Controllare il campione al microscopio per confermare che non siano rimasti colonoidi interi e che la maggior parte dei frammenti di colonoidi abbia una dimensione di circa 30-40 μm (Figura 1Bii). Se il campione richiede un’ulteriore dissociazione, incubare in bagnomaria a 37 °C per altri 3 minuti, ripetere la tecnica di pipettaggio al punto 2.7 e controllare il campione al microscopio. Ripetere questo processo fino a quando la maggior parte dei frammenti di colonoide non raggiunge le dimensioni ottimali.NOTA: Fare attenzione a non dissociare troppo i colonoidi in quanto ciò comporterà un’eccessiva morte cellulare, una bassa efficienza di placcatura e colonoidi sottodimensionati. Aggiungere 10 mL di Organoid Wash Media ghiacciato (Tabella 1) alla provetta da 15 mL. Centrifugare la provetta per 3 minuti a 400 × g, rimuovere il surnatante, risospendere in 1 mL di Organoid Wash Media ghiacciato e trasferirla in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL (denominata provetta per frammenti di colonoide). Miscelare il contenuto della provetta del frammento di colonoide mediante pipettaggio e prelevare un campione da 50 μl; trasferire questo campione da 50 μl in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 mL (denominata provetta per la conta cellulare). Conservare la provetta del frammento di colonoide sul ghiaccio da questo punto fino al completamento del passaggio 2.15. Centrifugare la provetta per la conta cellulare per 3 minuti a 400 × g, rimuovere il surnatante e risospendere in 500 μL di reagente di dissociazione enzimatica integrato con 10 μM dell’inibitore ROCK-I/II Y-27632. Incubare la provetta per la conta delle singole cellule nel bagno d’acqua a 37 °C per 5 minuti. Utilizzando una pipetta P1000 impostata su 400 μl, pipettare il campione come descritto al punto 2.7 e controllare il campione al microscopio per assicurarsi che vi sia una sospensione di una singola cellula. In caso contrario, ripetere questo processo fino a quando i colonoidi non sono completamente dissociati in una sospensione unicellulare. Aggiungere 1 mL di Organoid Wash Media alla provetta per la conta delle singole cellule, centrifugare per 3 minuti a 400 × g e rimuovere con cautela il surnatante. Risospendere le cellule in 50 μL di Organoid Wash Media e quindi aggiungere 50 μL di blu di tripano. Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Calcolare il numero di cellule nel campione da 50 μl e utilizzarlo per calcolare la concentrazione di cellule nella provetta del frammento colonoide. Calcolare il volume di sospensione cellulare richiesto per l’esperimento in cui verranno seminate 0,5 × 104 cellule colonoidi per pozzetto di una piastra per microtitolazione a 96 pozzetti. Aggiungi circa il 15% in più a questo volume calcolato per tenere conto del volume morto. Trasferire questo volume totale dalla provetta per frammenti di colonoide (passaggio 2.11) a una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 mL.Centrifugare la nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 ml contenente frammenti di colonoide per 3 minuti a 400 × g, rimuovere il surnatante e risospendere in BME (utilizzare 10 μl di BME per 0,5 × 104 cellule).NOTA: A causa delle caratteristiche fisiche del BME (alta viscosità, polimerizzazione dipendente dalla temperatura), una quantità significativa di materiale può essere persa attraverso il pipettaggio (volume morto). Posizionare la provetta o il serbatoio contenente la sospensione colonoide/BME sul ghiaccio in un contenitore sterile all’interno della cappa di biosicurezza.NOTA: Mantenere le cellule sul ghiaccio durante la semina impedisce al substrato cellulare di polimerizzare prematuramente. Utilizzando una piastra per microtitolazione preincubata a 96 pozzetti (dal passaggio 2.3), pipettare inversamente 10 μL della soluzione di colonoide/BME per pozzetto. Assicurarsi di posizionare la punta appena sopra la superficie del pozzetto e di pipettare al centro per evitare di colpire la parete del pozzetto. Mescolare regolarmente la sospensione colonoide/BME per evitare una semina irregolare.NOTA: Non seminare colonoidi nei pozzetti del bordo esterno della piastra per microtitolazione.Per invertire la pipetta:Posizionare la pipetta, quindi premere il pulsante dello stantuffo oltre il primo arresto fino al secondo. Mantenendo questa posizione, immergere la punta nella sospensione colonoide/BME e rilasciare lentamente lo stantuffo verso l’alto. Erogare la sospensione premendo delicatamente e costantemente il pulsante dello stantuffo fino al primo arresto. Se si seminano più pozzetti, mantenere questa posizione e ripetere i passaggi 2.18.1.2-2.18.1.3. Una volta terminato, espellere la piccola quantità di sospensione rimanente premendo il pulsante dello stantuffo fino al secondo arresto.NOTA: Si consiglia di utilizzare la tecnica di pipettaggio inverso a causa dell’elevata viscosità del BME. Capovolgere la piastra in modo uniforme e costante e incubare a 37 °C, 5% CO2 per 20 minuti. Rimuovere la piastra dall’incubatrice. Assicurarsi che il BME sia completamente polimerizzato e quindi sovrapporre le cupole con 200 μl di terreno di proliferazione degli organoidi preriscaldato. Se si utilizza una piastra per microtitolazione a 96 pozzetti con un fossato circostante (che riduce l’evaporazione), riempire ogni serbatoio con 2 mL di Organoid Wash Media. Incubare i colonoidi a 37 °C, 5% di CO2 per 3 giorni e ispezionare al microscopio una volta al giorno per assicurarsi che i colonoidi si siano ripresi e stiano proliferando. 3. Trattamenti colonoidi per il saggio della morte cellulare Preparare una soluzione da 2,5 μM di colorante fluorescente per la morte cellulare (SYTOX Green Nucleic Acid Stain) e una soluzione di DMSO aggiungendo un colorante fluorescente per la morte cellulare o DMSO ai terreni di proliferazione degli organoidi preriscaldati (Tabella 2).NOTA: Proteggere il colorante fluorescente per la morte cellulare e la soluzione diluita dalla luce. SYTOX Green Nucleic Acid Stain è solubilizzato in DMSO; la soluzione di DMSO viene utilizzata per preparare la condizione No Dye per controllare gli effetti del solvente. Utilizzare la soluzione da 2,5 μM di colorante fluorescente per la morte cellulare e la soluzione DMSO del passaggio 3.1 per preparare i trattamenti come mostrato nella Tabella 2. Rimuovere delicatamente il terreno dalla piastra per microtitolazione a 96 pozzetti seminata con colonoidi inclinando la piastra e pipettandola dal bordo dei pozzetti; quindi, aggiungere 200 μl di terreno di trattamento per pozzetto. Assicurarsi di disporre di pozzetti di controllo PBS/BSA aggiuntivi per le condizioni di tossicità massima (vedere la Tabella 2 per la mappa delle piastre). Incubare i colonoidi a 37 °C, 5% di CO2 per i punti temporali di trattamento richiesti fino al momento dell’imaging. Almeno 2 ore prima dell’imaging, preparare una soluzione al 10% v/v di Triton-X 100 in acqua sterile per colture cellulari e aggiungere 22 μl di Triton-X 100 al 10% direttamente al terreno dei pozzetti di controllo per la/e condizione/i di massima tossicità a una concentrazione finale dell’1% v/v 1 h prima dell’imaging.NOTA: L’uso di una soluzione al 10% riduce gli errori di pipettaggio che possono verificarsi a causa dell’elevata viscosità del tensioattivo. 4. Acquisizione delle immagini Rimuovere la piastra per microtitolazione a 96 pozzetti seminata con colonoidi dall’incubatore e trasferirla al tavolino di un microscopio digitale a epifluorescenza invertita. Lasciare che la piastra raggiunga la temperatura ambiente. Confermare che i colonoidi della condizione di massima tossicità siano completamente lisati esaminandoli al microscopio (Figura 1Biii). Selezionare un obiettivo adatto, come un obiettivo a fluorescenza 40x a lunga distanza di lavoro. Ottimizza le impostazioni di imaging del microscopio prima di iniziare.Utilizzando il canale di trasmissione, concentrarsi su un colonoide con cellule SYTOX-positive, passare alla proteina fluorescente verde (GFP)(488 nm) e regolare l’intensità della luce e il tempo di esposizione per massimizzare il segnale fluorescente riducendo al minimo lo sfondo. Innanzitutto, prova una bassa intensità luminosa, quindi aumenta gradualmente il tempo di esposizione; Se la durata dell’esposizione non è pratica, aumentare leggermente l’intensità della luce.NOTA: Aumentando il tempo di esposizione invece dell’intensità della luce si riduce la fototossicità e il fotosbiancamento dei campioni19. Esporre i campioni alla luce fluorescente solo quando necessario. Utilizzando le impostazioni di imaging ottimizzate per il canale GFP, osservare le condizioni di assenza di colorante e massima tossicità per garantire che i campioni non siano sovra o sottoesposti. Una volta finalizzate, mantenere le impostazioni di imaging coerenti tra le condizioni. Acquisisci immagini utilizzando un approccio di campionamento casuale: fallo selezionando i campi visivi (FOV) che seguono uno schema a griglia fissa che copre la cupola colonoide. Acquisisci immagini di colonoidi da un minimo di 10 FOV. Assicurarsi che il piano centrale del colonoide sia a fuoco e acquisire immagini sia nei canali di trasmissione che in quelli GFP.Applicare i seguenti criteri di esclusione.Non acquisire immagini se non sono presenti colonoidi nel FOV. Non acquisire immagini se nel FOV sono presenti solo colonoidi che si sovrappongono sullo stesso piano focale (Figura 1Biv). Non acquisire immagini se nel FOV sono presenti solo detriti colonoidi (Figura 1Bv). Non includere detriti colonoidi nell’analisi. Salva le immagini in formato grafico di rete portatile ed esportale. Se si esegue l’imaging di punti temporali aggiuntivi, riportare la piastra per microtitolazione a 96 pozzetti con colonoidi nell’incubatore a 37 °C, 5% CO2. 5. Analisi delle immagini Apri Fiji ImageJ e importa il set di dati dell’immagine trascinando i file sulla barra degli strumenti di ImageJ o navigando su File | Apri e seleziona i file. Una volta aperti, combina i file in una pila di immagini facendo clic su Immagine| Pile| Immagini da impilare. Converti la pila di immagini in formato file a 8 bit facendo clic su Immagine| Tipo| 8 bit. Per ogni set di immagini, fare clic sullo strumento Selezioni a mano libera sulla barra degli strumenti di ImageJ e selezionare manualmente l’area di interesse (ROI) sull’immagine di trasmissione utilizzando il mouse del computer; il ROI è il perimetro del colonoide. Quindi, passa da una pila di immagini all’altra fino all’immagine del canale GFP corrispondente. Fai clic su Analizza| impostare le misure; nella finestra di dialogo Imposta misure , selezionare Valore medio di grigio e lasciare deselezionate tutte le altre caselle. Con l’immagine GFP selezionata, fare clic su Analizza | Misurare. Ripeti questa analisi per ogni colonoide nella pila di immagini. Una volta analizzato il set di dati, copiare tutti i dati nella finestra Risultati e incollarli in un’applicazione software per fogli di calcolo. 6. Calcolo della tossicità massima % Calcolare la media dei valori medi di grigio (MGV) della replica tecnica per ciascuna condizione utilizzando l’equazione (1). (media del trattamento a) = (1) Esprimere la media di ciascuna condizione in percentuale rispetto alla media della condizione di massima tossicità (MT) utilizzando l’equazione (2).%MTa = (2) 7. Calcolo dell’IPC Normalizzare (NORM) i dati come segue, utilizzando i valori medi calcolati nel passaggio 6.1, sottrarre la media della condizione non trattata (UT) da ciascuna condizione di trattamento e la condizione di massima tossicità (MT) (per rimuovere la morte cellulare di fondo che si verifica indipendentemente dal trattamento con citochine). Quindi, dividere ciascuna condizione di trattamento per la media sottratta dallo sfondo della condizione di tossicità massima (MT) come mostrato nell’equazione (3).NORMAa = (3) Sottrarre da 1 i valori normalizzati calcolati al punto 7.1; i valori risultanti rappresentano la vitalità cellulare (V) dopo il trattamento (come nell’equazione (4) di seguito).Va = 1 −NORMa (4) Calcola il coefficiente di interazione perturbagena (CPI) utilizzando l’equazione (5):IPC = (5)Dove a denota il primo trattamento; b indica il secondo trattamento; e l’AB è il trattamento combinato. I valori dell’IPC indicano relazioni sinergiche (1).