Este protocolo describe un método simple y rentable para investigar y cuantificar la muerte celular en organoides colónicos humanos en respuesta a perturbaciones citotóxicas como las citocinas. El enfoque emplea un colorante fluorescente de muerte celular (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), microscopía de fluorescencia en vivo y software de análisis de imágenes de código abierto para cuantificar las respuestas de un solo organoide a estímulos citotóxicos.
La muerte de las células epiteliales intestinales (IEC) aumenta en pacientes con enfermedades inflamatorias intestinales (EII) como la colitis ulcerosa (CU) y la enfermedad de Crohn (EC). Esto puede contribuir a defectos en la función de la barrera intestinal, exacerbación de la inflamación e inmunopatogenia de la enfermedad. Las citocinas y los ligandos de los receptores de muerte son parcialmente responsables de este aumento en la muerte por IEC. Las citocinas relevantes para la EII, como el TNF-α y el IFN-γ, son citotóxicas para las IEC tanto de forma independiente como en combinación. Este protocolo describe un ensayo simple y práctico para cuantificar la citotoxicidad inducida por citocinas en organoides colónicos derivados de pacientes con EC utilizando un colorante fluorescente de muerte celular (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), microscopía de fluorescencia en vivo y software de análisis de imágenes de código abierto. También demostramos cómo utilizar el modelo matemático de independencia de Bliss para calcular un coeficiente de interacción perturbagénica (CPI) basado en la citotoxicidad de los organoides. El CPI se puede utilizar para determinar si las interacciones entre combinaciones de citocinas u otros tipos de perturbágenos son antagónicas, aditivas o sinérgicas. Este protocolo se puede implementar para investigar la actividad citotóxica de citocinas y otros perturbágenos utilizando organoides colónicos derivados de pacientes.
El epitelio intestinal crea una barrera física semipermeable entre el contenido de la luz intestinal y los tejidos subyacentes. Para mantener esta barrera de manera efectiva, las células epiteliales intestinales (IEC) se someten a un recambio celular extremadamente alto, con un ciclo continuo de muerte y regeneración celular. Sin embargo, durante los trastornos inflamatorios, como la enfermedad inflamatoria intestinal (EII), se producen niveles más altos de muerte celular aberrante1. Esto puede promover una ruptura en la función de barrera y la activación del sistema inmunológico, lo que desencadena una mayor inflamación. En la enfermedad de Crohn (EC), una forma de EII, se ha demostrado que la señalización de citocinas contribuye al aumento de los niveles de muerte por IEC2. Al estudiar cómo la señalización de citocinas induce la muerte celular de las IEC, se espera que se puedan desarrollar mejores tratamientos para los pacientes con EII y otros trastornos inflamatorios intestinales.
En biología y en la investigación de descubrimientos de dianas farmacológicas, se entiende generalmente que la sinergia se produce cuando un sistema biológico tratado con combinaciones de estímulos individuales muestra una respuesta a la combinación que es mayor que los efectos aditivos combinados de los estímulos individuales por sí solos. Las interacciones sinérgicas entre citocinas han sido bien documentadas en el impulso de las respuestas antivirales innatas3. También se sabe que las citocinas inducen la muerte celular de forma sinérgica, incluso en las IEC4. Sin embargo, el papel que desempeña la señalización sinérgica de citocinas citotóxicas en los trastornos inflamatorios intestinales como la EII está poco estudiado.
Los organoides intestinales humanos son microtejidos 3D producidos in vitro que se generan a partir de células madre epiteliales intestinales. Los organoides intestinales pueden cultivarse a partir de biopsias de la mucosa intestinal obtenidas de pacientes con EII y conservan muchas características de la enfermedad 5,6. Los organoides han demostrado ser un sistema modelo ideal para estudiar la citotoxicidad de las citocinas en el contexto de la inflamación intestinal 7,8. Previamente, nuestro grupo ha caracterizado los efectos matales sinérgicos de las citocinas IFN-γ y TNF-α relevantes para la EII en organoides colónicos (colonoides) derivados de pacientes con ECA9,10. Sin embargo, los mecanismos exactos implicados en la mediación de esta forma de muerte celular sinérgica siguen siendo difíciles de alcanzar. También hay potencialmente muchas más interacciones de citocinas citotóxicas no caracterizadas que son relevantes para los trastornos inflamatorios intestinales.
Existen varios protocolos para estudiar la muerte celular en organoides intestinales 10,11,12,13; Sin embargo, cada uno de ellos tiene inconvenientes. Algunas de estas técnicas solo miden la viabilidad celular y no miden la muerte celular directamente, son incapaces de evaluar las respuestas de un solo organoide o requieren equipos costosos y protocolos complejos. Se necesitan metodologías sólidas y sencillas para cuantificar la muerte celular de los organoides y las interacciones de las perturbaciones en los organoides intestinales. El protocolo que presentamos es un enfoque simple y económico para medir las respuestas de un solo organoide a citocinas citotóxicas, pero se puede utilizar para cualquier tipo de estímulo o perturbágeno. También demostramos cómo utilizar el modelo de sinergia de independencia de Bliss para calcular un coeficiente de interacción de perturbaciones (CPI) que describe las interacciones de citocinas citotóxicas.
Se han desarrollado varios métodos para el análisis cuantitativo de la muerte celular en organoides intestinales. El examen de la alteración de la morfología de los organoides intestinales mediante microscopía óptica es un enfoque sencillo para cuantificar los efectos de las sustancias citotóxicas11. Sin embargo, los cambios morfológicos no son una medida directa de la muerte celular, y el método es solo semicuantitativo. Otro método es evaluar la actividad metabólica de los organoides mediante un ensayo MTT o ATP10,11. Es importante tener en cuenta que estos ensayos solo pueden determinar cambios en la viabilidad celular y deben validarse con un ensayo de muerte celular. Se han descrito otros ensayos fluorométricos de muerte celular utilizando colorantes de unión al ADN12,13. Es posible un enfoque sin imagen que utilice un lector de microplacas fluorescentes y permite un alto rendimiento12. Sin embargo, este método mide la señal promedio de un pozo completo, por lo que no es adecuado para poblaciones heterogéneas. También requiere el uso de un lector de microplacas con ajuste de altura Z. Las técnicas basadas en imágenes fluorescentes se pueden utilizar para el análisis de organoides individuales y la captura de datos celulares/subcelulares y morfológicos. Los sistemas automatizados de imágenes confocales de alto contenido (HCI) pueden generar grandes cantidades de datos con un alto rendimiento13. Desafortunadamente, la HCI confocal necesita equipos especializados, utiliza protocolos complejos, generalmente requiere software comercial de análisis de imágenes y es costosa.
Nuestro protocolo para el análisis cuantitativo de la muerte de células colonoides en múltiples puntos de tiempo es sencillo, sencillo y económico. Sin embargo, en comparación con los sistemas automatizados de HCI y lectores de placas, requiere mucho tiempo y ha reducido el rendimiento. Otra limitación de nuestro método es el uso de microscopía de campo amplio en lugar de confocal. La microscopía confocal es más adecuada para obtener imágenes de muestras 3D gruesas, como organoides, ya que reduce la señal desenfocada y puede adquirir secciones ópticas en serie (pilas Z). Sin embargo, las imágenes confocales suelen requerir tiempos de adquisición más largos y láseres de alta intensidad que aumentan la fototoxicidad/fotoblanqueo. Es fundamental tener en cuenta que los colorantes fluorescentes de muerte celular como SYTOX Green solo son adecuados para medir formas de muerte celular en las que hay pérdida de la integridad de la membrana celular, como la necrosis, la necrosis secundaria asociada a la apoptosis tardía, la necroptosis y la piroptosis21. Existen algunas formas de muerte celular regulada en las que la membrana celular permanece impermeable al menos durante las primeras fases de la muerte celular, como la apoptosis dependiente de caspasas. Sin embargo, este protocolo podría modificarse fácilmente para incorporar también la obtención de imágenes de un indicador fluorescente de actividad 3/7 de caspasa22. Esto proporcionaría datos adicionales para ayudar a caracterizar la modalidad específica de muerte celular.
Utilizamos nuestro protocolo para demostrar la interacción sinérgica citotóxica entre las citocinas IFN-γ y TNF-α (Figura 2C), que hemos descrito previamente en organoides derivados de pacientes con EC 9,10. La relevancia fisiológica de esta forma de sinergismo también ha sido demostrada en modelos murinos de linfohistiocitosis hemofagocítica y sepsis23. Se han implementado varios modelos y enfoques matemáticos de referencia para cuantificar la sinergia entre combinaciones de agentes biológicos24,25. Difieren en cuanto a su complejidad, el número de factores que consideran y el umbral para considerar que una interacción es sinérgica24,25. Algunos modelos requieren un conocimiento previo de los agentes biológicos ensayados, hacen ciertas suposiciones sobre la actividad de los agentes y pueden requerir curvas completas de dosis-respuesta para cada tratamiento único y combinado25. El método que seleccionamos para medir la sinergia es una modificación del modelo del coeficiente de interacción farmacológica (CDI), que se ha utilizado previamente para medir los efectos inhibidores de las combinaciones de fármacos quimioterápicos sobre la proliferación de líneas celularescancerosas 26. El CDI es un modelo de independencia de Bliss; al calcular el efecto combinado predicho de dos perturbaciones, la independencia de Bliss supone que se dirigen a vías separadas y tienen mecanismos de acción independientes27. Para que una interacción entre perturbaciones sea sinérgica, el efecto combinado real debe ser mayor que el efecto predicho. Este modelo es apropiado para nuestra configuración experimental, ya que se sabe que el IFN-γ y el TNF-α tienen diferentes receptores y componentes de señalización posteriores. Además, la independencia de Bliss permite el cálculo de un coeficiente de interacción para cuantificar la sinergia y no requiere conjuntos de datos de dosis-respuesta.
Hay algunos factores clave que deben tenerse en cuenta para garantizar resultados óptimos para este protocolo. Es importante que los colonoides se propaguen a una alta densidad (Figura 1Bi), que tengan aproximadamente 25-50 μm de diámetro y que proliferen activamente antes de intentar sembrar células. El uso de cultivos subóptimos de colonoides para ensayos puede dar lugar a un número insuficiente de células, una baja recuperación de colonoides y experimentos inconsistentes. Para obtener resultados reproducibles, también es importante sembrar la densidad de colonoides de manera consistente entre experimentos. Se ha demostrado previamente que la respuesta in vitro a las citocinas inflamatorias puede ser influenciada por la densidad de siembra celular28,29. Otro problema común es la formación de burbujas de aire en la cúpula BME, que pueden afectar a las imágenes. Esto se puede prevenir mediante el uso de la técnica de pipeteo inverso. Esta técnica también da como resultado una siembra más consistente.
Además, si toma imágenes de varios puntos de tiempo, prepare una condición de toxicidad máxima para cada punto de tiempo. Triton-X 100, un tensioactivo no iónico, se usa comúnmente como control positivo (condición de toxicidad máxima) para ensayos de citotoxicidad. La adición de Triton-X 100 lisa y mata los colonoides, lo que permite que el tinte fluorescente de muerte celular ingrese a las células. El uso de una condición de toxicidad máxima de un punto de tiempo anterior dará como resultado una normalización inexacta e inconsistente de los datos debido a que la señal fluorescente decae con el tiempo.
Un último punto a tener en cuenta es la elección de BME utilizado para el cultivo de colonoides. Hay varios productores comerciales de BME; sin embargo, para nuestro protocolo, solo hemos probado la marca incluida en la Tabla de Materiales. Un estudio reciente utilizando organoides de cáncer de páncreas derivados de pacientes encontró que la fuente comercial de BME alteró las tasas de proliferación celular, pero no tuvo un efecto significativo sobre la respuesta a los medicamentos de quimioterapia o la expresión génica30. Teniendo esto en cuenta, esperamos que la tendencia de los resultados sea similar entre las marcas de BME para nuestro protocolo, pero recomendamos utilizar la misma marca de forma constante.
Demostramos cómo se puede utilizar este protocolo para el análisis de la muerte celular inducida por IFN-γ y TNF-α utilizando colonoides derivados de pacientes con EC. Los organoides intestinales derivados de pacientes son una herramienta poderosa para estudiar la EC, ya que conservan muchas características de la enfermedad, incluida una mayor sensibilidad a los efectos citotóxicos del TNF-α31. Sin embargo, el protocolo podría modificarse fácilmente para investigar los efectos citotóxicos de los perturbágenos distintos de las citocinas o de los estados patológicos distintos de la EII, como el cáncer colorrectal (hemos probado con éxito el protocolo utilizando colonoides no EII). Creemos que este método es útil para cualquier área de investigación relacionada con los mecanismos de muerte celular, la función de barrera epitelial o la inmunología de la mucosa intestinal.
The authors have nothing to disclose.
Los autores desean agradecer a los pacientes por su consentimiento informado y participación en el estudio de investigación, y al personal clínico por su excelente asistencia. La Figura 1A se creó con BioRender.com. Este trabajo contó con el apoyo de subvenciones de la Fundación de Ciencias de Irlanda, a saber, un premio de desarrollo profesional (CDA) para K.N. (SFI-13/CDA/2171), una subvención de centro de investigación (SFI-12/RC/2273) y un premio de radio para centro de investigación (SFI-14/SP/2710) para APC Microbiome Ireland. P.F. también recibió financiación del documento SFI/20/RP/9007.
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | |
Amphotericin B Solution | Sigma-Merck | A2942 | |
A-83-01 | Sigma-Merck | SML0788 | |
BioRender | Science Suite Inc. | N/A | Scientific illustration software |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Merck | A2058 | Essentially IgG-free, low endotoxin |
B27 Supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
CHIR-99021 | Sigma-Merck | SML1046 | |
Costar 48-well Clear TC-treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3548 | |
Cultrex Basement Membrane Extract, Type 2, Pathclear | R&D Systems | 3532-010-02 | Basement membrane extract |
Dimethyl sulfoxide | Sigma-Merck | D2650 | |
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Merck | D8537 | |
EVOS FL Digital Inverted Fluorescence Microscope | Invitrogen | AMF4300 | Digital inverted epifluorescence microscope |
EVOS 40x Objective, fluorite, LWD, phase-contrast | ThermoFisher Scientific | AMEP4683 | Long working distance 40x fluorescence objective |
Fiji/ImageJ (Windows version) | Open-source software | N/A | Image analysis software |
Foetal Bovine Serum | Sigma-Merck | F9665 | |
Gentamicin Solution | Sigma-Merck | G1397 | |
Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 100-0485 | Enzyme-free cell dissociation reagent |
GlutaMAX-1 | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine dipeptide supplement |
GraphPad Prism 5 (Windows version) | Dotmatics | N/A | Data graphics and statistics software |
Greiner 15 mL Polypropylene Centrifuge Tube, Sterile with conical bottom & Screw Cap | Cruinn | 188261CI | |
HEPES 1 M | Gibco | 15630080 | |
Human recombinant EGF (animal free) | Peprotech | AF-100-15 | |
N-Acetylcysteine | Sigma-Merck | A9165 | |
Nicotinamide | Sigma-Merck | N0636 | |
Normocin | InvivoGen | ant-nr-05 | Broad range antimicrobial reagent |
Nunc Edge 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | ThermoFisher Scientific | 15543115 | |
N2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | |
Recombinant Human IFN-gamma Protein | R&D Systems | 285-IF | Resuspend in sterile filtered 0.1% PBS/BSA |
Recombinant Human TNF-alpha Protein | R&D Systems | 210-TA | Resuspend in sterile filtered 0.1% PBS/BSA |
SB202190 | Sigma-Merck | S7067 | |
Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 3451 | |
SYTOX Green Nucleic Acid Stain – 5 mM Solution in DMSO | Invitrogen | S7020 | Fluorescent cell death dye, protect from light |
Triton X-100 | Sigma-Merck | 93420 | |
Trypan Blue solution | Sigma-Merck | T8154 | |
Tryple Express | Gibco | 12604013 | Enzymatic dissociation reagent |
Y-27632 | MedChemExpress | HY-10071 | Inhibitor of ROCK-I and ROCK-II |