כימות מוות תאי הנגרם על ידי ציטוקינים באורגנואידים של המעי הגס האנושי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי חי

ביופסיות רירית המעי הגס נאספו מחולים עם CD שעברו קולונוסקופיה שגרתית כחלק מהטיפול הסטנדרטי. אישור אתי לשימוש בדגימות רקמת מטופל ויצירת קווי אורגנואידים של המעי הגס מדגימות אלה התקבל מוועדת האתיקה למחקר קליני של בתי החולים להוראה בקורק (CREC). הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל החולים בהסכמה עם הצהרת הלסינקי. כל עבודת תרבית רקמות עם ביופסיות וקולונואידים של מטופלים חייבת להתבצע בתוך ארון בטיחות ביולוגית בהתאם לפרוטוקולי בטיחות BSL2. יש לוודא שכל בלאי הפלסטיק סטרילי לפני השימוש. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, הריאגנטים, המכשירים והתוכנות המשמשים בפרוטוקול זה. הפרוטוקולים שהקבוצה שלנו משתמשת בהם לבידוד קריפטה ותרבית אורגנואידים הותאמו משיטות מבוססות 14,15,16 ופורסמו בעבר 9,10,17. עבור הפרוטוקול הבא, קולונואידים תורבתו באמצעות Organoid Proliferation Media (טבלה 1). קולונואידים הגדלים באמצעות Organoid Proliferation Media אינם ממוינים ומועשרים עבור תאי גזע של המעי הגס. המרכיב העיקרי של Organoid Proliferation Media הוא 50% מדיה מותנית L-WRN, המכילה את גורמי הגדילה של נישה של תאי גזע במעי Wnt-3A (W), R-spondin 3 (R) ו- Noggin (N)15. Organoid Proliferation Media מיוצר על ידי שילוב של מדיה מותנית L-WRN ומדיה נטולת סרום 1:1, ולאחר מכן תוספת עם ניקוטינאמיד ומעכבים כימיים (טבלה 1). 1. בידוד קריפטה המעי הגס ותרבות קולונואיד לדגור מראש צלחת microtiter 48 באר ב 37 ° C, 5% CO2 במשך מינימום של 72 שעות לפני זריעה עם crypts.הערה: דגירה מוקדמת של הצלחת מאיצה את הפילמור של תמצית קרום המרתף (BME) במהלך הזריעה. להפשיר את BME על קרח ב 4 °C בערב לפני בידוד של crypts. יש לאסוף את הביופסיות של המעי הגס בצינורית איסוף דגימות המכילה 15 מ”ל של מדיום איסוף ביופסיה (טבלה 1) ולאחסן בטמפרטורה של 4°C עד להכנה לעיבוד. יש להסיר בזהירות כמה שיותר מדיום איסוף ביופסיה באמצעות פיפטה. שטפו את הביופסיות על ידי הוספת 15 מ”ל של DPBS קר כקרח בתוספת 2.5 מיקרוגרם / מ”ל אמפוטריצין B ו 100 מיקרוגרם / מ”ל גנטמיצין לצינור הדגימה. נערו את צינורית הדגימה במרץ כדי לנתק רירית או פסולת מהביופסיות. תן ביופסיות להתיישב על ידי כוח הכבידה בזהירות להסיר DPBS ככל האפשר באמצעות פיפטה.חזור על הליך הכביסה משלב 1.4 פעמיים (2x). הוסף 10 מ”ל של מגיב דיסוציאציה תאי ללא אנזימים בתוספת 2.5 מיקרוגרם / מ”ל אמפוטריצין B ו 200 מיקרוגרם / מ”ל גנטמיצין לצינור הדגימה ודגור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר עם נדנוד ב -30 סל”ד. לאחר הדגירה, נערו את צינור הדגימה מצד לצד ביד במרץ כדי לשחרר את הקריפטים של המעי הגס. בדוק את הצינור באמצעות מיקרוסקופ אור בעוצמה נמוכה וחפש את הקריפטים ושברי הקריפטה ששוחררו בתרחיף. אם אינו גלוי, נער את הצינור ובדוק שוב; חזור על הפעולה עד שהקריפטים נראים בהשעיה. חבר מסננת תאים של 70 מיקרומטר לצינור של 50 מ”ל וסנן את מתלה הקריפטה דרך המסננת. הוסף 10 מ”ל של מדיית שטיפת אורגנואידים קרה כקרח (טבלה 1) לצינורית הדגימה הריקה, הסר את המדיה והעבר אותה דרך מסננת התא. העבר את הקריפטות המסוננות לשני צינורות 15 מ”ל (10 מ”ל לכל צינור) וצנטריפוגה ב -4 ° C למשך 5 דקות ב 150 × גרם. הסר את הסופרנאטנט בזהירות מכל צינור 15 מ”ל, השהה מחדש את כדורי הקריפטה ב- 500 מיקרוליטר של מדיית שטיפת אורגנואידים קרה כקרח, העבר את תמיסת הקריפטה משני צינורות 15 מ”ל לצינור מיקרוצנטריפוגה יחיד של 1.5 מ”ל, וצנטריפוגה ב -4 ° C למשך 3 דקות ב 400 × גרם. בזהירות להסיר את supernatant מן צינור microcentrifuge ו resuspend את גלולת הקריפטה ב 70 μL של BME (20 μL לכל באר ו 10 μL של נפח מת נוסף). באמצעות צלחת 48 בארות מודגרת מראש (שלב 1.1), זרע 20 μL של BME/קריפטה מתלה למרכז כל באר (1 BME כיפה לכל באר). הופכים את הצלחת בצורה חלקה ויציבה ודגרים בטמפרטורה של 37°C, 5% CO2 למשך 20 דקות.הערה: היפוך הצלחת מונע מהתאים להיצמד למשטח הפלסטיק של הבאר ומבטיח את פיזורם בתוך ה-BME. מוציאים את הצלחת מהאינקובטור. ודא שה-BME עבר פולימריזציה מלאה ולאחר מכן כסה את הכיפות ב-350 מיקרוליטר של חומר התפשטות אורגנואידים שחומם מראש בתוספת 100 מיקרוגרם/מ”ל של מגיב אנטי-מיקרוביאלי רחב טווח. לדגור את הצלחת ב 37 ° C, 5% CO2.הערה: מגיב אנטי-מיקרוביאלי רחב טווח נועד למנוע זיהום מחיידקים ריריים הקשורים לביופסיות המעי הגס. זה נדרש רק בשבוע הראשון של התרבית לאחר בידוד קריפטה. שנה את המדיה 2-3x בשבוע באמצעות Organoid Proliferation Media שחומם מראש, בתוספת מגיב אנטי-מיקרוביאלי רחב טווח בשבוע הראשון של התרבית; לאחר תקופה זו, הסר את המגיב. לאחר התבססות התרבית הקולונואידית במלואה (1-2 שבועות לאחר הבידוד), יש לנתק את הקולונואידים באמצעות מגיב הדיסוציאציה האנזימטי בתוספת 10 מיקרומטר של מעכב ROCK-I/II Y-27632 (ראה סעיף 2 לפרטים מלאים על דיסוציאציה קולונואידית).הערה: עבור שני הקטעים הראשונים (P0-1, P1-2), יש להרחיב את הקולונואידים ביחס של 1:1/2; לאחר P2, קולונואידים יכולים לעבור באמצעות יחס של 1:3/4. זרעו ותחזקו את הקולונואידים בהתאם לשלבים 1.11-1.13 (אין להשלים את Organoid Proliferation Media עם מגיב אנטי-מיקרוביאלי בטווח רחב). 2. הכנת קולונואידים לבדיקת מוות תאי הערה: השלמת פרוטוקול בדיקת מוות תאי נמשכת 4 ימים (איור 1A). הרחיבו את הקולונואידים בפורמט צלחת של 48 בארות, זריעה של 20 מיקרוליטר של תרחיף BME/קריפטה לכל באר, דגירה בטמפרטורה של 37°C, 5% CO2, ושינוי המדיום 2-3x בשבוע (350 μL לכל באר). יש לעבור את הקולונואידים כשבוע לפני הקציר לבדיקת מוות תאי. לפני קצירת הקולונואידים, ודאו שהם מופצים לצפיפות גבוהה (איור 1Bi), שהם בקוטר של כ-25-50 מיקרומטר, ומתרבים באופן פעיל.הערה: השתמשנו בקולונואידים לבדיקה זו מקטע 3 לקטע 14 עם תוצאות עקביות. עם זאת, הוכח כי תגובת השעתוק של קולונואידים לציטוקינים יכולה להשתנות בהתאם למשך התרבית18. על בסיס זה, אנו ממליצים לא להשתמש בקולונואידים לבדיקה זו לאחר מעבר 15. יש לדגור מראש על לוחות מיקרוטיטר 96 בארות בטמפרטורה של 37°C, 5%CO2 למשך 72 שעות לפחות לפני הזריעה עם תאי קולונואידים. הפשיר את ה-BME על קרח ב-4 מעלות צלזיוס בערב שלפני תחילת הניסוי. הכינו נפח מספיק של מגיב הדיסוציאציה האנזימטית (500 מיקרוליטר לבאר קולונואידים) על ידי תוספת של 10 מיקרומטר של מעכב ROCK-I/II Y-27632. להסיר בעדינות את המדיום מן הבארות המכילות קולונואידים; פיפטה מקצה הבאר כדי למנוע פגיעה בכיפת הקולונואידים. הוסף 300 μL של מגיב דיסוציאציה אנזימטי לכל באר.עבור כל באר, לפרק את כיפת הקולונואיד על ידי גירוד פני השטח של הבאר עם קצה פיפטה P1000 ו pipeting את מתלה התא למעלה ולמטה; נסו להימנע מיצירת בועות אוויר. לאסוף את השעיית התא בצינור 15 מ”ל.הערה: צינור זה של 15 מ”ל ישמש לאיסוף קולונואידים מ-10 בארות של צלחת 48 הקידוחים. שטפו את אותה באר עם עוד 200 מיקרוליטר של מגיב הדיסוציאציה האנזימטית כדי להבטיח שכל החומר הקולונואידי נאסף ומועבר לאותו צינור של 15 מ”ל. חזור על תהליך זה עבור כל באר של קולונואידים מורחבים הנקצרים ואסוף אותם באותו צינור יחיד של 15 מ”ל.הערה: לדיסוציאציה יעילה, יש לאסוף מקסימום 10 בארות קולונואידים לכל צינור. אם אתם אוספים >10 בארות, יש לפצל את הקולונואידים שנאספו באופן שווה על פני צינורות מרובים של 15 מ”ל. לדגור על צינור 15 מ”ל עם קולונואידים שנאספו משלב 2.5.2 באמבט מים ב 37 ° C במשך 5 דקות. לאחר הדגירה, צנטריפוגה את הצינור במשך 3 דקות ב 400 × גרם. הסר בעדינות את supernatant, משאיר כ 1.2 מ”ל מאחור בצינור.הערה: השלב הבא דורש דיסוציאציה פיזית של קולונואידים באמצעות פיפטינג מהיר. כדי שזה יהיה יעיל, אתה חייב להיות נפח קטן של השעיית התא בצינור – 1.2 מ”ל שנותר בצינור 15 מ”ל מספיק למטרה זו. להשעות מחדש את גלולת הקולונואיד ב -1.2 מ”ל הנותרים של מגיב הדיסוציאציה האנזימטי. בעזרת פיפטה P1000 המוגדרת ל-1,000 מיקרוליטר, הניחו את קצה הפיפטה לתוך המתלה, החזיקו אותה בדיוק מעל החלק התחתון של צינור ה-15 מ”ל, ולאחר מכן הכניסו במהירות את המתלה פנימה והחוצה מהקצה. כדי לבצע פיפטה במהירות, לחץ במהירות על כפתור הבוכנה לתחנה הראשונה, שחרר את הכפתור עד שהוא בערך באמצע הדרך למיקום העליון, וחזור על הפעולה. פיפטה במהירות במשך כ 10 s (30-40 שקעים), ולאחר מכן להשעות את המתלה במלואו לחזור על pipetting. בצע 2-3 סיבובים של פיפטינג מהיר. בדקו את הדגימה מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שלא נותרו קולונואידים שלמים ושרוב מקטעי הקולונואידים הם בגודל של כ-30-40 מיקרומטר (איור 1Bii). אם הדגימה דורשת דיסוציאציה נוספת, יש לדגור באמבט המים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות נוספות, לחזור על טכניקת הצנרת בשלב 2.7 ולבדוק את הדגימה תחת המיקרוסקופ. חזור על תהליך זה עד שרוב מקטעי הקולונואיד הם בגודל האופטימלי.הערה: היזהר לא לנתק את הקולונואידים יותר מדי מכיוון שהדבר יגרום למוות תאי מוגזם, יעילות ציפוי נמוכה וקולונואידים בגודל נמוך. הוסף 10 מ”ל של אמצעי שטיפה אורגנואידים קרים כקרח (טבלה 1) לצינור של 15 מ”ל. צנטריפוגה את הצינור למשך 3 דקות ב 400 × גרם, להסיר את supernatant, resuspend ב 1 מ”ל של Organoid Wash Media קר כקרח, ולהעביר צינור microcentrifuge 1.5 מ”ל (המכונה צינור קטע קולונואידים). מערבבים את התוכן של צינור קטע קולונואיד על ידי pipetting ולקחת דגימה 50 μL; העבר דגימה זו של 50 μL לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מ”ל (המכונה צינור ספירת תאים). אחסנו את צינור שבר הקולונואיד על קרח מנקודה זו ועד להשלמת שלב 2.15. צנטריפוגה את צינור ספירת התאים למשך 3 דקות ב 400 × גרם, להסיר את supernatant, ולהשהות מחדש ב 500 μL של מגיב דיסוציאציה אנזימטי בתוספת 10 μM של מעכב ROCK-I/II Y-27632. לדגור על צינור ספירת התאים היחיד באמבט המים ב 37 ° C במשך 5 דקות. באמצעות פיפטה P1000 המוגדרת ל-400 μL, פיפטה את הדגימה כמתואר בשלב 2.7 ובדוק את הדגימה תחת המיקרוסקופ כדי לוודא שיש תרחיף חד-תאי. אם לא, חזור על תהליך זה עד שהקולונואידים מנותקים לחלוטין לתרחיף חד-תאי. הוסף 1 מ”ל של מדיית שטיפה אורגנואידית לצינור ספירת התאים היחיד, צנטריפוגה למשך 3 דקות ב 400 × גרם והסר בזהירות את supernatant. להשהות מחדש את התאים ב 50 μL של Organoid Wash Media ולאחר מכן להוסיף 50 μL של כחול טריפאן. לספור את התאים באמצעות hemocytometer. חשב את מספר התאים במדגם 50 μL והשתמש בו כדי לחשב את ריכוז התאים בצינור מקטע המעי הגס. חשב את נפח תרחיף התא הדרוש לניסוי שבו 0.5 × 104 תאי קולונואיד ייזרעו לכל באר של צלחת מיקרוטיטר 96 באר. הוסף כ- 15% נוספים לנפח מחושב זה כדי לקחת בחשבון נפח מת. העבר נפח כולל זה מצינור מקטע המעי הגס (שלב 2.11) לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מ”ל.צנטריפוגה את צינור המיקרוצנטריפוגה החדש בנפח 1.5 מ”ל המכיל שברי קולונואיד למשך 3 דקות ב-400 × גרם, מוציאים את הסופר-נטנט ומשהים מחדש ב-BME (יש להשתמש ב-10 מיקרוליטר BME לכל 0.5 × 104 תאים).הערה: בשל המאפיינים הפיזיים של BME (צמיגות גבוהה, פילמור תלוי טמפרטורה), כמות משמעותית של חומר יכולה ללכת לאיבוד באמצעות פיפטינג (נפח מת). מקמו את הצינור או המאגר המכיל את מתלה הקולונואידים/BME על קרח במיכל סטרילי בתוך ארון הבטיחות הביולוגית.הערה: שמירה על התאים על קרח בזמן הזריעה מונעת ממצע התא להתפלמר בטרם עת. באמצעות לוחית מיקרוטיטר 96 בארות מודגרת מראש (משלב 2.3), פיפטה הפוכה 10 μL של תמיסת קולונואיד/BME לכל באר. הקפידו למקם את הקצה ממש מעל פני השטח של הבאר ואת פיפטה למרכז כדי למנוע פגיעה בקיר הבאר. ערבבו את מתלה הקולונואידים/BME באופן קבוע כדי למנוע זריעה לא אחידה.הערה: אין לזרוע קולונואידים בבארות הקצה החיצוני של צלחת המיקרוטיטר.כדי להפוך פיפטה:הגדר את פיפטה ולאחר מכן לחץ על כפתור הבוכנה מעבר לתחנה הראשונה לתחנה השנייה. בהחזקת תנוחה זו, טבלו את הקצה במתלה הקולונואידים/BME ושחררו לאט את הבוכנה למעלה. שחררו את המתלים על ידי לחיצה עדינה ויציבה על כפתור הבוכנה עד לתחנה הראשונה. אם זורעים בארות נוספות, החזק במצב זה וחזור על שלבים 2.18.1.2-2.18.1.3. לאחר שתסיים, סלק את הכמות הקטנה של המתלים שנותרו על ידי לחיצה על כפתור הבוכנה לתחנה השנייה.הערה: אנו ממליצים להשתמש בטכניקת פיפטינג הפוך בשל צמיגות גבוהה של BME. הופכים את הצלחת בצורה חלקה ויציבה ודגרים בטמפרטורה של 37°C, 5% CO2 למשך 20 דקות. מוציאים את הצלחת מהאינקובטור. ודא שה-BME עבר פולימריזציה מלאה ולאחר מכן, כסה את הכיפות ב-200 μL של מדיית התפשטות אורגנואידים שחוממה מראש. אם אתם משתמשים בפלטת מיקרוטיטר בעלת 96 בארות עם חפיר מסביב (המפחיתה אידוי), מלאו כל מאגר ב-2 מ”ל של מדיית שטיפה אורגנואידית. לדגור על הקולונואידים ב 37 ° C, 5% CO2 במשך 3 ימים ולבדוק מיקרוסקופית פעם ביום כדי להבטיח את הקולונואידים התאוששו והם מתרבים. 3. טיפולים בקולונואידים לבדיקת מוות תאי הכינו תמיסה של 2.5 מיקרומטר של צבע מוות תאי פלואורסצנטי (SYTOX Green Nucleic Acid Stain) ותמיסת DMSO על-ידי הוספת צבע פלואורסצנטי למוות תאים או DMSO למדיה להפצת אורגנואידים שחוממו מראש (טבלה 2).הערה: הגן על מלאי הצבעים של מוות תאי הפלואורסצנטי ועל התמיסה המדוללת מפני אור. כתם חומצת גרעין ירוקה SYTOX מסיס ב-DMSO; פתרון DMSO משמש להכנת תנאי No Dye לבקרה על השפעות ממס. השתמש בתמיסת 2.5 מיקרומטר של צבע מוות תאי פלואורסצנטי ותמיסת DMSO משלב 3.1 כדי להכין טיפולים כפי שמוצג בטבלה 2. להסיר בעדינות את המדיום מן צלחת microtiter 96 באר זרע קולונואידים על ידי הטיית הצלחת pipetting מקצה הבארות; לאחר מכן, להוסיף 200 μL של מדיום הטיפול לכל באר. ודא שיש לך בארות בקרה נוספות של PBS/BSA עבור תנאי הרעילות המרבית (ראה טבלה 2 למפת הלוחות). לדגור על הקולונואידים בטמפרטורה של 37°C, 5%CO2 עבור נקודות הזמן הדרושות לטיפול עד שהם מוכנים להדמיה. לפחות שעתיים לפני ההדמיה, הכינו תמיסה של 10% v/v של Triton-X 100 במים סטריליים בדרגת תרבית תאים והוסיפו 22 μL של 10% Triton-X 100 ישירות לתווך של בארות הבקרה עבור תנאי הרעילות המרבית לריכוז סופי של 1% v/v 1 שעה לפני ההדמיה.הערה: שימוש בתמיסה של 10% מפחית שגיאות צנרת שעלולות להתרחש עקב צמיגות גבוהה של חומר פעילי שטח. 4. רכישת תמונות הסר את צלחת המיקרוטיטר בת 96 הבארות שנזרעה בקולונואידים מהאינקובטור והעבר לשלב של מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי הפוך דיגיטלי. תנו לצלחת להגיע לטמפרטורת החדר. אשרו שהקולונואידים במצב רעילות מרבית עוברים ליזה מלאה על-ידי בחינתם תחת המיקרוסקופ (איור 1, Biii). בחר מטרה מתאימה, כגון יעד פלואורסצנטי של 40x למרחק עבודה ארוך. מטב את הגדרות ההדמיה של המיקרוסקופ לפני שתתחיל.באמצעות ערוץ ההולכה, התמקדו בקולונואיד עם תאים חיוביים ל-SYTOX, עברו לחלבון הפלואורסצנטי הירוק (GFP)ערוץ (488 ננומטר), וכוונן את עוצמת האור ואת זמן החשיפה כדי למקסם את האות הפלואורסצנטי תוך מזעור הרקע. ראשית, נסה עוצמת אור נמוכה, ולאחר מכן להגדיל בהדרגה את זמן החשיפה; אם משך החשיפה אינו מעשי, הגדל מעט את עוצמת האור.הערה: הארכת זמן החשיפה במקום עוצמת האור תפחית את רעילות האור ואת ההלבנה של הדגימות19. חשוף את הדגימות לאור פלואורסצנטי רק בעת הצורך. באמצעות הגדרות ההדמיה הממוטבות עבור ערוץ GFP, שימו לב לתנאי הרעילות ללא צבע ומקס כדי להבטיח שהדגימות אינן חשופות יתר או תת-חשיפה. לאחר הסיום, שמור על עקביות בהגדרות ההדמיה בין התנאים. רכשו תמונות בגישת דגימה אקראית: עשו זאת על ידי בחירת שדות ראייה (FOV) העוקבים אחר תבנית רשת קבועה המכסה את כיפת הקולונואידים. רכוש תמונות של קולונואידים ממינימום של 10 FOVs. ודא שהמישור המרכזי של הקולונואיד נמצא בפוקוס וקבל תמונות הן בערוצי שידור והן בערוצי GFP.החל את קריטריוני ההחרגה הבאים.אין לרכוש תמונות אם אין קולונואידים נוכחים ב- FOV. אל תשיגו תמונות אם יש רק קולונואידים חופפים באותו מישור מוקד שנמצא ב-FOV (איור 1Biv). אל תשיגו תמונות אם יש רק פסולת קולונואידים ב-FOV (איור 1Bv). אין לכלול פסולת קולונואידים בניתוח. שמור תמונות בפורמט גרפי של רשת ניידת וייצוא. אם מדמים נקודות זמן נוספות, מחזירים את צלחת המיקרוטיטר 96 בארות עם קולונואידים לאינקובטור ב 37 ° C, 5% CO2. 5. ניתוח תמונות פתח את Fiji ImageJ וייבא את ערכת נתוני התמונה על-ידי גרירה ושחרור של הקבצים בסרגל הכלים ImageJ או ניווט אל File | פתח ובחר את הקבצים. לאחר הפתיחה, שלב את הקבצים לאוסף תמונות על-ידי לחיצה על תמונה| ערימות | תמונות לערימה. המר את אוסף התמונות לתבנית קובץ של 8 סיביות על-ידי לחיצה על תמונה| סוג| 8 סיביות. לכל ערכת תמונות, לחצו על הכלי בחירות חופשיות בסרגל הכלים ImageJ ובחרו ידנית באזור העניין (ROI) בתמונת השידור באמצעות עכבר המחשב; החזר ההשקעה הוא היקף הקולונואיד. לאחר מכן, עברו בין אוסף התמונות לתמונת ערוץ GFP המתאימה. לחץ על נתח | קביעת מדידות; בחלון הדו-שיח ‘ קביעת מדידות’ , סמן את האפשרות ‘ערך אפור ממוצע ‘ והשאר את כל שאר התיבות לא מסומנות. כשתמונת GFP נבחרה, לחץ על נתח | למדוד. חזור על ניתוח זה עבור כל קולונואיד בערימת התמונות. לאחר ניתוח ערכת הנתונים, העתק את כל הנתונים בחלון התוצאות והדבק אותם ביישום תוכנת גיליון אלקטרוני. 6. חישוב רעילות מקסימלית % חשב את הממוצע של הערכים האפורים הממוצעים (MGV) עבור כל תנאי באמצעות משוואה (1). (ממוצע הטיפול א) = (1) בטא את הממוצע של כל תנאי כאחוז ביחס לממוצע של תנאי רעילות מרבית (MT) באמצעות משוואה (2).%MTa = (2) 7. חישוב מדד המחירים לצרכן נרמול (NORM) של הנתונים באופן הבא, באמצעות הערכים הממוצעים המחושבים בשלב 6.1, החסרו את הממוצע של המצב הלא מטופל (UT) מכל תנאי טיפול ואת תנאי הרעילות המרבית (MT) (כדי להסיר את מוות תאי הרקע המתרחש ללא תלות בטיפול בציטוקינים). לאחר מכן, חלק כל תנאי טיפול בממוצע הרקע של תנאי רעילות מרבית (MT) כפי שמוצג במשוואה (3).נורמהa = (3) חסר את הערכים המנורמלים המחושבים בשלב 7.1 מ- 1; הערכים המתקבלים מייצגים את כדאיות התא (V) לאחר הטיפול (כמו במשוואה (4) להלן).Va = 1 −NORMa (4) חשב את מקדם האינטראקציה perturbagen (CPI) באמצעות משוואה (5):מדד המחירים לצרכן = (5)כאשר A מציין את הטיפול הראשון; B מציין את הטיפול השני; ו-AB הוא הטיפול המשולב. ערכי מדד המחירים לצרכן מציינים קשרים סינרגטיים (1).