Quantificação da morte celular induzida por citocinas em organoides colônicos humanos usando microscopia de fluorescência ao vivo

Biópsias da mucosa colônica foram coletadas de pacientes com DC submetidos a colonoscopia de rotina como parte do tratamento padrão. A aprovação ética para o uso de amostras de tecido de pacientes e a geração de linhagens organoides colônicas a partir dessas amostras foi obtida do Comitê de Ética em Pesquisa Clínica dos Hospitais Universitários de Cork (CREC). O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes de acordo com a Declaração de Helsinque. Todo o trabalho de cultura de tecidos com biópsias de pacientes e colonoides deve ser realizado dentro de um gabinete de biossegurança seguindo os protocolos de segurança BSL2. Certifique-se de que todo o desgaste do plástico seja estéril antes de usar. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, reagentes, instrumentos e software usados neste protocolo. Os protocolos que nosso grupo usa para isolamento de criptas e cultura de organoides foram adaptados de métodos estabelecidos 14,15,16 e foram publicados anteriormente 9,10,17. Para o protocolo a seguir, os colonoides foram cultivados usando meios de proliferação organoide (Tabela 1). Os colonoides cultivados usando meios de proliferação organoide são indiferenciados e enriquecidos para células-tronco colônicas. O principal componente do meio de proliferação organoide é o meio condicionado com 50% de L-WRN, que contém os fatores de crescimento de nicho de células-tronco intestinais Wnt-3A (W), R-spondin 3 (R) e Noggin (N)15. O meio de proliferação organoide é preparado pela combinação de meios condicionados com L-WRN e meios sem soro 1:1, seguidos de suplementação com nicotinamida e inibidores químicos (Tabela 1). 1. Isolamento de criptas colônicas e cultura de colonóides Pré-incubar uma placa de microtitulação de 48 poços a 37 °C, 5% de CO2 por um mínimo de 72 h antes de semear com criptas.NOTA: A pré-incubação da placa acelera a polimerização do extrato da membrana basal (BME) durante a semeadura. Descongelar o BME em gelo a 4 °C na noite anterior ao isolamento das criptas. Colete as biópsias colônicas em um tubo de coleta de amostras contendo 15 mL de meio de coleta de biópsia (Tabela 1) e armazene a 4 ° C até que estejam prontas para processamento. Remova cuidadosamente o máximo possível de meio de coleta de biópsia usando uma pipeta. Lave as biópsias adicionando 15 mL de DPBS gelada suplementada com 2,5 μg/mL de anfotericina B e 100 μg/mL de gentamicina ao tubo de amostra. Agite o sample tubo vigorosamente para dissociar qualquer muco ou detritos das biópsias. Deixe as biópsias assentarem por gravidade e remova cuidadosamente o máximo de DPBS possível usando uma pipeta.Repita o procedimento de lavagem da etapa 1.4 duas vezes (2x). Adicione 10 mL de reagente de dissociação de células livres de enzimas suplementado com 2,5 μg/mL de anfotericina B e 200 μg/mL de gentamicina ao tubo de amostra e incube por 15 min em temperatura ambiente com balanço a 30 rpm. Após a incubação, agite vigorosamente o tubo de amostra de um lado para o outro com a mão para liberar as criptas colônicas. Inspecione o tubo usando um microscópio de luz de baixa potência e procure as criptas liberadas e fragmentos de cripta em suspensão. Se não estiver visível, agite o tubo e verifique novamente; Repita até que as criptas sejam vistas em suspensão. Conecte um filtro de células de 70 μm a um tubo de 50 mL e filtre a suspensão da cripta através do filtro. Adicione 10 mL de meio de lavagem organoide gelado (Tabela 1) ao tubo de amostra vazio, remova o meio e passe-o pelo filtro de células. Transferir as criptas filtradas para dois tubos de 15 ml (10 ml por tubo) e centrifugar a 4 °C durante 5 min a 150 × g. Remova o sobrenadante cuidadosamente de cada tubo de 15 mL, ressuspenda os grânulos de cripta em 500 μL de meio de lavagem organoide gelado, transfira a solução de cripta de ambos os tubos de 15 mL para um único tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e centrifugue a 4 ° C por 3 min a 400 × g. Remova cuidadosamente o sobrenadante do tubo de microcentrífuga e ressuspenda o pellet de cripta em 70 μL de BME (20 μL por poço e 10 μL de volume morto extra). Usando a placa pré-incubada de 48 poços (etapa 1.1), semeie 20 μL de suspensão de BME/cripta no centro de cada poço (1 cúpula de BME por poço). Inverter a placa de forma suave e constante e incubar a 37 °C, 5% de CO2 durante 20 min.NOTA: A inversão da placa evita que as células adiram à superfície plástica do poço e garante sua distribuição dentro do BME. Remova a placa da incubadora. Certifique-se de que o BME esteja totalmente polimerizado e, em seguida, cubra as cúpulas com 350 μL de meio de proliferação organoide pré-aquecido suplementado com 100 μg/mL de um reagente antimicrobiano de ampla faixa. Incubar a placa a 37 °C, 5% CO2.NOTA: O reagente antimicrobiano de ampla gama é para evitar a contaminação por micróbios da mucosa associados às biópsias do cólon. Só é necessário para a primeira semana de cultura após o isolamento da cripta. Troque o meio 2-3x em uma semana usando meios de proliferação organoide pré-aquecidos, complementando com o reagente antimicrobiano de ampla gama para a primeira semana de cultura; Após este período, remova o reagente. Assim que a cultura do colonóide estiver totalmente estabelecida (1-2 semanas após o isolamento), dissocie os colonóides usando o reagente de dissociação enzimática suplementado com 10 μM do inibidor ROCK-I/II Y-27632 (consulte a seção 2 para obter detalhes completos sobre a dissociação do colonóide).NOTA: Para as duas primeiras passagens (P0-1, P1-2), os colonóides devem ser expandidos usando uma proporção de 1:1/2; após P2, os colonóides podem ser passados usando uma proporção de 1:3/4. Semeie e mantenha os colonoides seguindo as etapas 1.11-1.13 (não suplemente os meios de proliferação organoide com o reagente antimicrobiano de ampla gama). 2. Preparação de colonóides para ensaio de morte celular NOTA: O protocolo de ensaio de morte celular leva 4 dias para ser concluído (Figura 1A). Expanda os colonoides usando um formato de placa de 48 poços, semeando 20 μL de BME/suspensão de cripta por poço, incubando a 37 °C, 5% de CO2 e trocando o meio 2-3x por semana (350 μL por poço). Passe os colonoides aproximadamente 1 semana antes da colheita para o ensaio de morte celular. Antes de colher os colonoides, certifique-se de que eles sejam propagados a uma alta densidade (Figura 1Bi), que tenham aproximadamente 25-50 μm de diâmetro e estejam proliferando ativamente.NOTA: Usamos colonóides para este ensaio da passagem 3 à passagem 14 com resultados consistentes. No entanto, foi demonstrado que a resposta transcricional dos colonoides às citocinas pode mudar dependendo da duração da cultura18. Com base nisso, recomendamos não usar colonóides para este ensaio após a passagem 15. Pré-incubar placas de microtitulação de 96 poços a 37 °C, 5% de CO2 por um mínimo de 72 h antes da semeadura com células colonoides. Descongelar o BME em gelo a 4 °C na noite anterior ao início da experiência. Preparar um volume suficiente do reagente de dissociação enzimática (500 μL por alvéolo de colonóides) suplementando com 10 μM do inibidor ROCK-I/II Y-27632. Remova suavemente o meio dos poços contendo colonóides; pipeta da borda do poço para evitar danificar a cúpula do colonóide. Adicione 300 μL de reagente de dissociação enzimática a cada poço.Para cada poço, separe a cúpula do colonóide raspando a superfície do poço com a ponta de uma pipeta P1000 e pipetando a suspensão da célula para cima e para baixo; Tente evitar gerar bolhas de ar. Recolha a suspensão celular num tubo de 15 ml.NOTA: Este tubo de 15 mL será usado para coletar colonóides de 10 poços da placa de 48 poços. Lave o mesmo poço com mais 200 μL do reagente de dissociação enzimática para garantir que todo o material colonóide seja coletado e transferido para o mesmo tubo de 15 mL. Repita este processo para cada poço de colonóides expandidos que estão sendo colhidos e colete-os no mesmo tubo único de 15 mL.NOTA: Para uma dissociação eficiente, um máximo de 10 poços de colonóides devem ser coletados por tubo. Se estiver coletando >10 poços, divida os colonoides coletados igualmente em vários tubos de 15 mL. Incubar o tubo de 15 ml com os colonoides recolhidos do passo 2.5.2 em banho-maria a 37 °C durante 5 min. Após a incubação, centrifugue o tubo por 3 min a 400 × g. Remova suavemente o sobrenadante, deixando aproximadamente 1,2 mL para trás no tubo.NOTA: A próxima etapa requer a dissociação física dos colonóides usando pipetagem rápida. Para que isso seja eficaz, você deve ter um pequeno volume de suspensão celular no tubo – os 1,2 mL restantes no tubo de 15 mL são suficientes para esse fim. Ressuspenda o sedimento do colonóide nos 1,2 ml restantes do reagente de dissociação enzimática. Usando uma pipeta P1000 ajustada para 1.000 μL, coloque a ponta da pipeta na suspensão, segurando-a logo acima da parte inferior do tubo de 15 mL e, em seguida, pipete rapidamente a suspensão para dentro e para fora da ponta. Para pipetar rapidamente, pressione rapidamente o botão do êmbolo até a primeira parada, solte o botão até que esteja aproximadamente na metade do caminho para a posição superior e repita. Pipetar rapidamente durante cerca de 10 s (30-40 depressões), depois voltar a suspender totalmente a suspensão e repetir a pipetagem. Execute 2-3 rodadas de pipetagem rápida. Verifique a amostra ao microscópio para confirmar que não há colonóides inteiros e que a maioria dos fragmentos de colonóides tem aproximadamente 30-40 μm de tamanho (Figura 1Bii). Se a amostra necessitar de mais dissociação, incubar em banho-maria a 37 °C durante mais 3 minutos, repetir a técnica de pipetagem no passo 2.7 e verificar a amostra ao microscópio. Repita esse processo até que a maioria dos fragmentos de colonóides tenha o tamanho ideal.NOTA: Tenha cuidado para não dissociar muito os colonoides, pois isso resultará em morte celular excessiva, baixa eficiência de revestimento e colonóides subdimensionados. Adicione 10 mL de meio de lavagem organoide gelado (Tabela 1) ao tubo de 15 mL. Centrifugue o tubo por 3 min a 400 × g, remova o sobrenadante, ressuspenda em 1 mL de meio de lavagem organoide gelado e transfira para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL (conhecido como tubo de fragmento de colonoide). Misturar o conteúdo do tubo de fragmentos de colonóides pipetando e colher uma amostra de 50 μl; transfira esta amostra de 50 μL para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL (referido como tubo de contagem de células). Armazene o tubo de fragmento de colonóide no gelo a partir deste ponto até a conclusão da etapa 2.15. Centrifugue o tubo de contagem de células por 3 min a 400 × g, remova o sobrenadante e ressuspenda em 500 μL de reagente de dissociação enzimática suplementado com 10 μM do inibidor ROCK-I / II Y-27632. Incubar o tubo de contagem de células individuais no banho-maria a 37 °C durante 5 min. Usando uma pipeta P1000 ajustada para 400 μL, pipetar a amostra conforme descrito na etapa 2.7 e verificar a amostra ao microscópio para garantir que haja uma suspensão de célula única. Caso contrário, repita esse processo até que os colonóides estejam totalmente dissociados em uma suspensão unicelular. Adicione 1 mL de Organoid Wash Media ao tubo de contagem de células únicas, centrifugue por 3 min a 400 × g e remova cuidadosamente o sobrenadante. Ressuspenda as células em 50 μL de Organoid Wash Media e, em seguida, adicione 50 μL de azul de tripano. Conte as células usando um hemocitômetro. Calcule o número de células na amostra de 50 μL e use-o para calcular a concentração de células no tubo de fragmento do colonóide. Calcule o volume de suspensão celular necessário para o experimento onde 0,5 × 104 células colonóides serão semeadas por poço de uma placa de microtitulação de 96 poços. Adicione aproximadamente 15% a mais a esse volume calculado para contabilizar o volume morto. Transfira este volume total do tubo de fragmento do colonóide (etapa 2.11) para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.Centrifugue o novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo fragmentos de colonóides por 3 min a 400 × g, remova o sobrenadante e ressuspenda em BME (use 10 μL de BME por 0,5 × 104 células).NOTA: Devido às características físicas do BME (alta viscosidade, polimerização dependente da temperatura), uma quantidade significativa de material pode ser perdida por pipetagem (volume morto). Coloque o tubo ou reservatório contendo a suspensão de colonóide/BME em gelo em um recipiente estéril dentro do gabinete de biossegurança.NOTA: Manter as células no gelo durante a semeadura evita que o substrato celular polimerize prematuramente. Usando uma placa de microtitulação pré-incubada de 96 poços (da etapa 2.3), pipete reversa 10 μL da solução de colonóide/BME por poço. Certifique-se de posicionar a ponta logo acima da superfície do poço e pipetar no centro para evitar bater na parede do poço. Misture a suspensão de colonóide / BME regularmente para evitar a semeadura irregular.NOTA: Não semeie colonóides nos poços da borda externa da placa de microtitulação.Para reverter a pipeta:Ajuste a pipeta e pressione o botão do êmbolo após a primeira parada até a segunda parada. Mantendo esta posição, mergulhe a ponta na suspensão colonóide/BME e solte lentamente o êmbolo para cima. Dispense a suspensão pressionando o botão do êmbolo suave e firmemente até o primeiro batente. Se semear mais poços, mantenha essa posição e repita as etapas 2.18.1.2-2.18.1.3. Uma vez terminado, expulse a pequena quantidade de suspensão restante pressionando o botão do êmbolo até a segunda parada.NOTA: Recomendamos o uso da técnica de pipetagem reversa devido à alta viscosidade do BME. Inverter a placa de forma suave e constante e incubar a 37 °C, 5% de CO2 durante 20 min. Remova a placa da incubadora. Certifique-se de que o BME esteja totalmente polimerizado e, em seguida, cubra as cúpulas com 200 μL de meio de proliferação organoide pré-aquecido. Se estiver usando uma placa de microtitulação de 96 poços com um fosso ao redor (que reduz a evaporação), encha cada reservatório com 2 mL de meio de lavagem organoide. Incubar os colonoides a 37 °C, 5% de CO2 durante 3 dias e inspecionar microscopicamente uma vez por dia para garantir que os colonoides recuperaram e estão a proliferar. 3. Tratamentos colonóides para ensaio de morte celular Prepare uma solução de 2,5 μM de corante de morte celular fluorescente (SYTOX Green Nucleic Acid Stain) e solução de DMSO adicionando corante de morte celular fluorescente ou DMSO ao meio de proliferação organoide pré-aquecido (Tabela 2).NOTA: Proteja o corante de morte celular fluorescente e a solução diluída da luz. A mancha de ácido nucleico verde SYTOX é solubilizada em DMSO; a solução de DMSO é usada para preparar a condição Sem Corante para controlar os efeitos do solvente. Use a solução de 2,5 μM de corante de morte celular fluorescente e solução de DMSO da etapa 3.1 para preparar os tratamentos conforme mostrado na Tabela 2. Remova suavemente o meio da placa de microtitulação de 96 poços semeada com colonóides, inclinando a placa e pipetando a partir da borda dos poços; em seguida, adicione 200 μL de meio de tratamento por poço. Certifique-se de ter poços de controle PBS/BSA extras para a(s) condição(ões) de toxicidade máxima (consulte a Tabela 2 para o mapa da placa). Incubar os colonoides a 37 °C, 5% de CO2 para os pontos de tempo de tratamento necessários até que estejam prontos para a imagem. Pelo menos 2 h antes da aquisição de imagens, prepare uma solução a 10% v/v de Triton-X 100 em água estéril para cultura de células e adicione 22 μL de Triton-X 100 a 10% diretamente ao meio dos poços de controle para a(s) condição(ões) de toxicidade máxima até uma concentração final de 1% v/v 1 h antes da imagem.NOTA: O uso de uma solução a 10% reduz os erros de pipetagem que podem ocorrer devido à alta viscosidade do surfactante. 4. Aquisição de imagem Remova a placa de microtitulação de 96 poços semeada com colonóides da incubadora e transfira para o estágio de um microscópio digital de epifluorescência invertida. Deixe a placa atingir a temperatura ambiente. Confirme se os colonoides da condição de toxicidade máxima estão totalmente lisados, examinando-os ao microscópio (Figura 1Biii). Selecione uma objetiva adequada, como uma objetiva de fluorescência de 40x de longa distância de trabalho. Otimize as configurações de imagem do microscópio antes de começar.Usando o canal de transmissão, concentre-se em um colonóide com células positivas para SYTOX, mude para a Proteína Fluorescente Verde (GFP)canal (488 nm) e ajuste a intensidade da luz e o tempo de exposição para maximizar o sinal fluorescente enquanto minimiza o fundo. Primeiro, tente uma intensidade de luz baixa e, em seguida, aumente gradualmente o tempo de exposição; Se a duração da exposição for impraticável, aumente ligeiramente a intensidade da luz.NOTA: Aumentar o tempo de exposição em vez da intensidade da luz reduzirá a fototoxicidade e o fotobranqueamento das amostras19. Exponha as amostras à luz fluorescente apenas quando necessário. Usando as configurações de imagem otimizadas para o canal GFP, observe as condições Sem Corante e Toxicidade Máxima para garantir que as amostras não estejam superexpostas ou subexpostas. Uma vez finalizado, mantenha as configurações de imagem consistentes entre as condições. Adquira imagens usando uma abordagem de amostragem aleatória: faça isso selecionando campos de visão (FOVs) que seguem um padrão de grade fixo que cobre a cúpula do colonoide. Adquira imagens de colonóides de um mínimo de 10 FOVs. Certifique-se de que o plano central do colonoide esteja em foco e adquira imagens nos canais de transmissão e GFP.Aplique os seguintes critérios de exclusão.Não adquira imagens se não houver colonóides presentes no FOV. Não adquira imagens se houver apenas colonoides sobrepostos no mesmo plano focal presente no FOV (Figura 1Biv). Não adquira imagens se houver apenas detritos colonoides presentes no FOV (Figura 1Bv). Não inclua detritos colonoides na análise. Salve imagens em formato gráfico de rede portátil e exporte. Se houver pontos de tempo adicionais, retorne a placa de microtitulação de 96 poços com colonóides para a incubadora a 37 °C, 5% CO2. 5. Análise de imagem Abra o Fiji ImageJ e importe o conjunto de dados da imagem arrastando e soltando os arquivos na barra de ferramentas do ImageJ ou navegando até Arquivo | Abra e selecione os arquivos. Depois de aberto, combine os arquivos em uma pilha de imagens clicando em Imagem | Pilhas| Imagens para empilhar. Converta a pilha de imagens para o formato de arquivo de 8 bits clicando em Imagem| Tipo| 8 bits. Para cada conjunto de imagens, clique na ferramenta Seleções à mão livre na barra de ferramentas do ImageJ e selecione manualmente a região de interesse (ROI) na imagem de transmissão usando o mouse do computador; o ROI é o perímetro do colonoide. Em seguida, alterne entre a pilha de imagens e a imagem do canal GFP correspondente. Clique em Analisar| Definir medidas; na janela de diálogo Definir medidas , marque Valor médio de cinza e deixe todas as outras caixas desmarcadas. Com a imagem GFP selecionada, clique em Analisar | Medir. Repita essa análise para cada colonoide na pilha de imagens. Depois que o conjunto de dados for analisado, copie todos os dados na janela Resultados e cole-os em um aplicativo de software de planilha. 6. % de cálculo da toxicidade máxima Calcular a média dos valores médios de cinzento (MGV) para cada condição utilizando a equação (1). (média do tratamento a) = (1) Expresse a média de cada condição como uma porcentagem em relação à média da condição de toxicidade máxima (MT) usando a equação (2).%MTa = (2) 7. Cálculo do IPC Normalize (NORM) os dados da seguinte forma, usando os valores médios calculados na etapa 6.1, subtraia a média da condição não tratada (UT) de cada condição de tratamento e da condição de toxicidade máxima (MT) (para remover a morte celular de fundo que ocorre independentemente do tratamento com citocinas). Em seguida, divida cada condição de tratamento pela média subtraída de fundo da condição de toxicidade máxima (MT), conforme mostrado na equação (3).NORMAa = (3) Subtraia os valores normalizados calculados na etapa 7.1 de 1; os valores resultantes representam a viabilidade celular (V) após o tratamento (como na equação (4) abaixo).Va = 1 −NORMAa (4) Calcular o coeficiente de interacção perturbagénica (CPI) utilizando a equação (5):IPC = (5)Onde a denota o primeiro tratamento; b denota o segundo tratamento; e AB é o tratamento combinado. Os valores de CPI indicam relações sinérgicas (1).