Aplicaciones de la espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida en la investigación de productos naturales: alcaloides tropanos como estudio de caso

Aunque las moléculas totalmente sintéticas se han vuelto más prominentes en el descubrimiento de fármacos en las últimas décadas, casi dos tercios de todos los medicamentos aprobados en los últimos 39 años son productos naturales o inspirados en productos ^{naturales,1,2}  lo que subraya la importancia continua de la investigación de productos naturales. Los alcaloides, ciertos productos naturales que contienen nitrógeno, son especialmente apreciados por sus propiedades medicinales. Alcaloides tropanos (AT) que contienen el [3.2.1.]-sistema bicíclico que contiene nitrógeno, son producidos principalmente por plantas de las familias Solanaceae (solanáceas), Erythroxylaceae y Convolvulaceae. Algunos ejemplos son la atropina, la escopolamina y la cocaína; Múltiples tropanos semisintéticos o sintéticos también se utilizan clínicamente³. Los TA y sus derivados se utilizan para tratar muchas afecciones ^3,4 y varios de estos fármacos aparecen en la Lista de Medicamentos Esenciales 2023 de la OMS⁵. Debido a sus potentes actividades, los TA también se utilizan con fines recreativos (como estimulantes o delirantes) y pueden causar envenenamiento por ingestión de plantas (o preparados) que los contienen ^6,7. Los TA son indeseables en la alimentación humana y animal⁸ y pueden contaminar tés, especias, granos, miel y suplementos herbales ^9,10. Debido tanto a su promesa medicinal como a su capacidad para envenenar, los métodos analíticos que pueden ayudar en el descubrimiento de nuevos ATs (y la identificación de los AT conocidos) son útiles.

En la espectrometría de masas en tándem (MS/MS), los “filtros de masas” (por ejemplo, cuadrupolos, tubos de tiempo de vuelo) se acoplan físicamente (“en el espacio”), o un instrumento emplea pasos adicionales de reacción/separación “en el tiempo”. La MS/MS en el espacio utiliza diferentes modos para seleccionar y fragmentar diferentes iones en los diferentes filtros de masa (por ejemplo, los cuadrupolos de un instrumento de triple cuadrupolo o QQQ). Estos diferentes modos se pueden utilizar para determinar qué fragmentos específicos son formados por un ion dado (escaneo de iones de producto), qué iones en una muestra producen ciertos fragmentos (escaneo de iones precursores o PrIS) o sufren pérdidas de una masa característica (escaneo de pérdida neutra o NLS), o qué compuestos específicos poseen qué fragmentos específicos (monitoreo de reacciones múltiples). MS/MS, por lo tanto, proporciona fragmentos que son útiles para proponer estructuras para nuevos compuestos o confirmar la presencia de un compuesto existente. La MS/MS se utiliza cada vez más en los campos del descubrimiento de fármacos, la química de productos naturales y la metabolómica^11,12, y se ha utilizado para perfilar especies que contienen alcaloides (para la caracterización fitoquímica o el análisis quimiotaxonómico) y para detectar y cuantificar alcaloides específicos en alimentos o plantas medicinales 10,13,14,15,16.

A pesar de las muchas técnicas de espectrometría de masas disponibles, existen desafíos para encontrar nuevos alcaloides. Además de encontrar un organismo candidato para el cribado, la confirmación estructural completa de un alcaloide es un proceso arduo que puede incluir muchas técnicas analíticas diferentes. Además, los investigadores pudieron aislar un compuesto que ya se conoce, desperdiciando trabajo, tiempo y recursos. Esto es especialmente difícil para las AT, donde se reportan cientos, si no miles de TA, muchas de las cuales son isoméricas entre sí. El proceso de “identificar lo conocido y distinguirlo de lo desconocido” se conoce como dereplicación. Se publican bases de datos de los tiempos de retención (r.t.s) y fragmentos de masa de diferentes ATs y otros compuestos para ayudar en este proceso ^17,18. No obstante, la dereplicación es laboriosa; El mero hecho de anotar (es decir, asignar estructuras putativas a) los alcaloides en todo el cromatograma LC-MS/MS de una muestra lleva mucho tiempo. Recientemente, tanto la red molecular^{1 9,20} como la dereplicación manual 18,21,22 se han utilizado para la bencilisoquinolina, el indol monoterpénico y los alcaloides tropanos, y los PrISs se han utilizado para el “filtrado estructural” de espectros para identificar pirrolizidina y alcaloides de tipo solanina ^23,24. Sin embargo, no hay métodos o flujos de trabajo específicos disponibles para la dereplicación rápida basada en LC-MS/MS de muestras que contienen TA, a pesar de que los TA poseen fragmentos comunes y fácilmente identificables (Figura 1). El método descrito aquí utiliza una combinación de escaneos de iones de productos dependientes de datos (DD), PrISs y NLSs para anotar y clasificar las estructuras de TA en plantas en función de los distintos patrones de fragmentación para tropanos mono-, di- y trisustituidos (Figura 1A) y las pérdidas de grupos de ésteres comunes encontrados en estos alcaloides (Figura 1B). Los organismos de estudio son varias especies del género de solanáceas Datura. Una rica fuente de diversos ATs, la Datura se ha utilizado a lo largo de la historia del mundo con fines medicinales y culturales¹⁷– y es una matriz difícil de replicar debido a sus numerosos TA estructuralmente similares, lo que nos proporciona muestras atractivas sobre las que probar nuestro método.