Anwendungen der Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie in der Naturstoffforschung: Tropanalkaloide als Fallstudie

Obwohl vollsynthetische Moleküle in den letzten Jahrzehnten in der Arzneimittelforschung immer mehr an Bedeutung gewonnen haben, sind fast zwei Drittel aller zugelassenen Arzneimittel der letzten 39 Jahre Naturstoffe oder von Naturstoffen ^{inspiriert1,2}  was die anhaltende Bedeutung der Naturstoffforschung unterstreicht. Alkaloide, bestimmte stickstoffhaltige Naturstoffe, werden besonders wegen ihrer medizinischen Eigenschaften geschätzt. Tropanalkaloide (TAs), die die [3.2.1.]-bizyklische, stickstoffhaltige Systeme werden hauptsächlich von Pflanzen aus den Familien der Nachtschattengewächse (Nachtschattengewächse), Erythroxylaceae und Convolvulaceae produziert. Beispiele sind Atropin, Scopolamin und Kokain; Mehrere halbsynthetische oder synthetische Tropane werden auch klinisch eingesetzt³. TAs und ihre Derivate werden zur Behandlung vieler Erkrankungen eingesetzt ^3,4 und mehrere dieser Medikamente stehen auf der WHO-Liste der unentbehrlichen Arzneimittel^{2023 5}. Aufgrund ihrer starken Wirkung werden TAs auch in der Freizeit (als Stimulanzien oder Deliranten) konsumiert und können bei der Einnahme von Pflanzen (oder Zubereitungen), die sie enthalten, Vergiftungen verursachen ^6,7. TAs sind in menschlicher und tierischer Nahrung unerwünscht⁸ und können Tees, Gewürze, Getreide, Honig und pflanzliche Nahrungsergänzungsmittel verderben ^9,10. Aufgrund ihres medizinischen Versprechens und ihrer Fähigkeit, zu vergiften, sind analytische Methoden, die bei der Entdeckung neuer TAs (und der Identifizierung bekannter TAs) helfen können, nützlich.

Bei der Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) werden “Massenfilter” (z. B. Quadrupolen, Flugzeitröhren) physikalisch miteinander gekoppelt (“im Weltraum”), oder ein Gerät verwendet zusätzliche “in-time”-Reaktions-/Trennschritte. MS/MS im Weltraum verwendet verschiedene Modi, um verschiedene Ionen an den verschiedenen Massenfiltern auszuwählen und zu fragmentieren (z. B. die Quadrupole eines Triple-Quadrupol- oder QQQ-Instruments). Mit diesen verschiedenen Modi kann bestimmt werden, welche spezifischen Fragmente von einem bestimmten Ion gebildet werden (Product-Ionen-Scan), welche Ionen in einer Probe bestimmte Fragmente ergeben (Precursor-Ionen-Scan oder PrIS) oder Verluste einer charakteristischen Masse aufweisen (Neutral Loss Scan oder NLS) oder welche spezifischen Verbindungen welche spezifischen Fragmente besitzen (Mehrfachreaktionsüberwachung). MS/MS liefert daher Fragmente, die nützlich sind, um Strukturen für neue Verbindungen vorzuschlagen oder das Vorhandensein einer bestehenden Verbindung zu bestätigen. MS/MS wird zunehmend in den Bereichen Arzneimittelforschung, Naturstoffchemie und Metabolomik eingesetzt^11,12 und wurde zur Profilierung alkaloidhaltiger Spezies (für die phytochemische Charakterisierung oder chemotaxonomische Analyse) und zum Nachweis und zur Quantifizierung spezifischer Alkaloide in Lebensmitteln oder Heilpflanzen verwendet 10,13,14,15,16.

Trotz der vielen verfügbaren massenspektrometrischen Techniken gibt es Herausforderungen bei der Suche nach neuen Alkaloiden. Neben der Suche nach einem Kandidatenorganismus für das Screening ist die vollständige strukturelle Bestätigung eines Alkaloids ein mühsamer Prozess, der viele verschiedene Analysetechniken umfassen kann. Darüber hinaus könnten Forscher eine bereits bekannte Verbindung isolieren, was Arbeit, Zeit und Ressourcen verschwendet. Dies ist besonders schwierig für TAs, wo Hunderte, wenn nicht Tausende von TAs gemeldet werden, von denen viele isomer zueinander sind. Der Prozess des “Identifizierens des Bekannten und des Unterscheidens von den Unbekannten” wird als Dereplikation bezeichnet. Datenbanken der Retentionszeiten (r.t.s.) und Massenfragmente verschiedener TAs und anderer Verbindungen werden veröffentlicht, um diesen Prozess zu unterstützen ^17,18. Nichtsdestotrotz ist die Dereplikation mühsam; Allein das Annotieren (d. h. das Zuweisen von mutmaßlichen Strukturen) der Alkaloide im gesamten LC-MS/MS-Chromatogramm einer Probe ist zeitaufwändig. In jüngster Zeit wurden sowohl die molekulare Vernetzung^{1 9,20} als auch die manuelle Dereplikation 18,21,22 für Benzylisochinolin, Monoterpen-Indol und Tropanalkaloide verwendet, und PrISs wurden für die “strukturelle Filterung” von Spektren zur Identifizierung von Pyrrolizidin- und Solanin-Alkaloiden verwendet ^23,24. Es gibt jedoch keine spezifischen Methoden oder Workflows für eine schnelle LC-MS/MS-basierte Dereplikation von TA-haltigen Proben, obwohl TAs gemeinsame, leicht identifizierbare Fragmente besitzen (Abbildung 1). Die hier beschriebene Methode verwendet eine Kombination aus datenabhängigen (DD) Produktionenscans, PrISs und NLSs, um TA-Strukturen in Pflanzen zu annotieren und zu klassifizieren, basierend sowohl auf den unterschiedlichen Fragmentierungsmustern für mono-, di- und trisubstituierte Tropane (Abbildung 1A) als auch auf den Verlusten gemeinsamer Estergruppen, die in diesen Alkaloiden gefunden wurden (Abbildung 1B). Bei den untersuchten Organismen handelt es sich um mehrere Arten der Nachtschattengewächse Gattung Datura. Datura ist eine reichhaltige Quelle für verschiedene TAs und wurde im Laufe der Weltgeschichte für medizinische und kulturelle Zwecke verwendet¹⁷ – und ist aufgrund seiner zahlreichen, strukturell ähnlichen TAs eine schwierige Matrix, die es zu dereplizieren gilt, was uns ansprechende Proben liefert, an denen wir unsere Methode testen können.