Doğal Ürün Araştırmalarında Sıvı Kromatografi Tandem Kütle Spektrometresinin Uygulamaları: Bir Vaka Çalışması Olarak Tropan Alkaloidleri
Summary
Hızlı kütle spektrometresi (MS)/kütle spektrometresi (MS) tabanlı tropan alkaloidlerinin açıklanması ve sınıflandırılması için hem tropan içeren numunelerin ön replikasyonu hem de izolasyon için yeni alkaloidlerin keşfi için yararlı bir yöntem sunuyoruz.
Abstract
Günümüzde kullanılan birçok ilaç sentetik kökenli olmasına rağmen, doğal ürünler hala zengin bir yeni kimyasal çeşitlilik ve biyoaktivite kaynağı sağlamakta ve dirençli veya yeni ortaya çıkan hastalıklar için umut verici ipuçları verebilmektedir. Bununla birlikte, zorluk iki yönlüdür: araştırmacılar sadece doğal ürünler bulmak ve yapılarını aydınlatmak zorunda değil, aynı zamanda neyin izole edilmeye ve tahlil edilmeye değer olduğunu (ve zaten bilinenleri – çoğaltma olarak bilinen bir süreç) belirlemelidirler. Modern analitik enstrümantasyonun ortaya çıkmasıyla birlikte, doğal ürün keşfi ve çoğaltmanın hızı hızlandı. Sıvı kromatografisi-tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS), kimyasal yapıların tanımlanması ve sınıflandırılması için özellikle değerli bir teknik haline gelmiştir. Tropan alkaloidleri (TA’lar), büyük tıbbi ve toksikolojik öneme sahip bitki türevli bileşiklerdir. Bu çalışmada, TA yapılarını farklı parçalanma modellerine göre açıklamak ve sınıflandırmak için üçlü dört kutuplu (QQQ) kütle spektrometresinde bulunan çoklu MS/MS konfigürasyonlarını kullanarak LC-MS/MS tabanlı bir tarama iş akışı geliştirdik. Veriye bağlı (DD) ürün iyon taramaları, öncü iyon taramaları (PrIS) ve nötr kayıp taramalarının (NLS) bir kombinasyonunu kullanarak, bu yöntemi patlıcangiller Datura stramonium ve Datura metel’in TA açısından zengin özlerine uyguladık.Bu yöntem hızlı, hassastır ve hem karmaşık TA içeren numunelerin ön replikasyonu hem de izolasyon, saflaştırma (ve nihai biyo-tahlil) için yeni bir adayın keşfi için başarıyla kullanılmıştır.
Introduction
Her ne kadar tam sentetik moleküller son yıllarda ilaç keşfinde daha belirgin hale gelmiş olsa da, son 39 yılda onaylanan tüm ilaçların yaklaşık üçte ikisi doğal ürünler veya doğal ürünlerden ilham alan ilaçlardır.1,2 bu da doğal ürün araştırmalarının devam eden öneminin altını çizmektedir. Bazı azot içeren doğal ürünler olan alkaloidler, tıbbi özellikleri nedeniyle özellikle değerlidir. [3.2.1.] içeren tropan alkaloidleri (TA’lar)-bisiklik azot içeren sistem, çoğunlukla Solanaceae (patlıcangilgiller), Erythroxylaceae ve Convolvulaceae familyalarındaki bitkiler tarafından üretilir. Örnekler arasında atropin, skopolamin ve kokain; Klinik olarak çoklu yarı sentetik veya sentetik tropanlar da kullanılmaktadır3. TA’lar ve türevleri birçok durumu tedavi etmek için kullanılmaktadır 3,4 ve bu ilaçların birçoğu DSÖ’nün 2023 Temel İlaçlar Listesi’ndeyer almaktadır 5. Güçlü aktiviteleri nedeniyle, TA’lar rekreasyonel olarak da kullanılır (uyarıcı veya deliriant olarak) ve onları içeren bitkilerin (veya müstahzarların) yutulması üzerine zehirlenmeye neden olabilir 6,7. TA’lar insan ve hayvan gıdalarındaistenmeyen bir durumdur 8 ve çayları, baharatları, tahılları, balı ve bitkisel takviyeleribozabilir 9,10. Hem tıbbi vaatleri hem de zehirleme yetenekleri nedeniyle, yeni TA’ların keşfedilmesine (ve bilinen TA’ların tanımlanmasına) yardımcı olabilecek analitik yöntemler yararlıdır.
Tandem kütle spektrometresinde (MS/MS), “kütle filtreleri” (örneğin, dört kutuplular, uçuş süresi tüpleri) fiziksel olarak (“uzayda”) birleştirilir veya bir cihaz ek “zaman içi” reaksiyon / ayırma adımları kullanır. Uzayda MS/MS, farklı kütle filtrelerinde (örneğin, üçlü dört kutuplu veya QQQ cihazının dört kutupluları) farklı iyonları seçmek ve parçalamak için farklı modlar kullanır. Bu farklı modlar, belirli bir iyon tarafından hangi spesifik fragmanların yapıldığını (ürün iyonu taraması), bir numunedeki hangi iyonların belirli fragmanları verdiğini (öncü iyon taraması veya PrIS) veya karakteristik bir kütle kaybına uğradığını (nötr kayıp taraması veya NLS) veya hangi spesifik bileşiklerin hangi spesifik fragmanlara sahip olduğunu (çoklu reaksiyon izleme) belirlemek için kullanılabilir. Bu nedenle MS/MS, yeni bileşikler için yapılar önermek veya mevcut bir bileşiğin varlığını doğrulamak için yararlı olan parçalar sağlar. MS/MS, ilaç keşfi, doğal ürünler kimyası ve metabolomik alanlarda giderek daha fazla kullanılmaktadır11,12 ve alkaloid içeren türlerin profilini çıkarmak (fitokimyasal karakterizasyon veya kemotaksonomik analiz için) ve gıda veya tıbbi bitkilerde spesifik alkaloidleri tespit etmek ve ölçmek için kullanılmıştır 10,13,14,15,16.
Mevcut birçok kütle spektrometresi tekniğine rağmen, yeni alkaloidlerin bulunmasında zorluklar vardır. Taranacak aday bir organizma bulmanın yanı sıra, bir alkaloidin tam bir yapısal doğrulaması, birçok farklı analitik tekniği içerebilen zorlu bir süreçtir. Ek olarak, araştırmacılar zaten bilinen bir bileşiği izole ederek emek, zaman ve kaynakları boşa harcayabilirler. Bu, birçoğu birbiriyle izomerik olan yüzlerce, hatta binlerce TA’nın rapor edildiği TA’lar için özellikle zordur. “Bilinenleri tanımlama ve onları bilinmeyenlerden ayırt etme” süreci replikasyon olarak bilinir. Bu işleme yardımcı olmak için farklı TA’ların ve diğer bileşiklerin alıkonma sürelerinin (rts) ve kütle fragmanlarının veri tabanları yayınlanmaktadır17,18. Bununla birlikte, çoğaltma zahmetlidir; bir numunenin tüm LC-MS/MS kromatogramındaki alkaloidlere yalnızca açıklama eklemek (yani, varsayılan yapıları atamak) zaman alıcıdır. Son zamanlarda, hem moleküler ağ1 9,20 hem de manuel dereplikasyon18,21,22, benzilizokinolin, monoterpen indol ve tropan alkaloidleri için kullanılmıştır ve Pris’ler, pirolizidin ve solanin tipi alkaloidleri tanımlamak için spektrumların “yapısal filtrelemesi” için kullanılmıştır23,24. Bununla birlikte, TA’lar ortak, kolayca tanımlanabilir parçalara sahip olsa da, TA içeren örneklerin hızlı LC-MS/MS tabanlı replikasyonu için belirli yöntemler veya iş akışları yoktur (Şekil 1). Burada açıklanan yöntem, hem mono-, di- ve trisübstitüe tropanlar için farklı parçalanma modellerine (Şekil 1A) hem de bu alkaloidlerde bulunan ortak ester gruplarının kayıplarına (Şekil 1B) dayalı olarak bitkilerdeki TA yapılarını açıklamak ve sınıflandırmak için veriye bağlı (DD) ürün iyon taramaları, PrIS’ler ve NLS’lerin bir kombinasyonunu kullanır. Çalışma organizmaları, patlıcangiller cinsi Datura’daki birkaç türdür. Çeşitli TA’lar için zengin bir kaynak olan Datura, dünya tarihi boyunca tıbbi ve kültürel amaçlar için kullanılmıştır17– ve çok sayıda, yapısal olarak benzer TA’ları nedeniyle kopyalanması zor bir matristir ve bize yöntemimizi test etmek için çekici örnekler sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokolde sağlanan cihaz parametreleri tatmin edici bir performansa izin verse de, bu yöntemin başarılı bir şekilde kullanılması, birkaç kritik adımın dikkatli bir şekilde ele alınmasını veya optimize edilmesini gerektirebilir. Adım 2.2’de sağlanan HPLC çözücü gradyanı genellikle tropan alkaloidleri için uygun olsa da, incelenen numunenin veya bitki türünün tropan alkaloid profiline bağlı olarak modifiye edilmesi gerekebilir. Numune enjeksiyon hacmi, cihazın…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, bir Fakülte Araştırma Bursu (Kuzey Michigan Üniversitesi, MAC’ye verildi), bir lisans araştırma bursu (Kuzey Michigan Üniversitesi, JC’ye verildi) ve Kimya Bölümü tarafından finanse edildi. Yazarlar, bitki dokusu hazırlama konusunda yardım için John Berger’e (NMU), LC-MS bakım ve sorun giderme yardımı için Hannah Hawkins’e (NMU) ve asetiltropin karışımını hazırladıkları için Dr. Ryan Fornwald ve CH 495 (Doğal Ürünler Sentezi) öğrencilerine teşekkür etmek isterler. Yazarlar ayrıca Dr. Daniel Jones’a (Michigan State Üniversitesi) yüksek çözünürlüklü MS/MS spektrumları elde ettiği için teşekkür etmek isterler.
Materials
| Acetonitrile, For UHPLC, suitable for mass spectometry | Sigma-Aldrich | 900667 | HPLC solvent |
| Argon gas | AirGas | AR UHP300 | CID gas |
| Formic acid, 99% for analysis | Thermo Scientific | AC270480010 | HPLC additive |
| Guard column holder | Restek | 25812 | |
| HPLC, Shimadzu LC-2030C 3D Plus | Shimadzu | 228-65802-58 | HPLC column |
| LCMS, Shimdazu LCMS-8045 | Shimadzu | 225-31800-44 | Mass spectrometer; we ran LabSolutions software, which is standard for Shimadzu instruments |
| Liquid nitrogen | AirGas | NI 180LT22 | |
| Methanol, for HPLC/UHPLC/LCMS | VWR | BDH 85800.400 | For making extraction solvent |
| Microcentrifuge | VWR | 2400-37 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Mortar | Fisher Scientific | FB961C | For grinding plant tissues |
| Pestle | Fisher Scientific | FB961M | For grinding plant tissues |
| Pipette 1000 mL | Gilson | F144059M | |
| Pipette tip 1000 mL | Fisher scientific | 02-707-404 | |
| Plant tissues | Various sources | N/A | Can be anything wild or cultivated |
| Polypropylene conical tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-539-4 | |
| Polystyrene cooler | ULINE | S-18312 | The type of coolers that reagents for molecular biology are shipped in would be appropriate |
| Roc C18 3 µm, 100 mm x 4.6 mm | Restek | 9534315 | HPLC column |
| Roc C18, 10 mm x 4 mm | Restek | 953450210 | Guard column |
| Rocking shaker | Themo Scientific | 11-676-680 | |
| Screw thread vial convenience kit (9 mm) | Fisher scientific | 13-622-190 | LCMS autosampler vials |
| Syringe, 3 mL | Fisher Scientific | 03-377-27 | |
| Syringe filter 0.45 µm | Avantor/VWR | 76479-008 | |
| Water, for use in liquid chromatography and mass spectrometry | JT Baker | 9831-03 | For making extraction solvent |
| Water solution, contains 0.1% v/v formic acid, For UHPLC, suitable for mass spectometry | Sigma-Aldrich | 900687-1L | HPLC solvent |
References
- Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural products as sources of new drugs over the 30 years from 1981 to 2010. J Nat Prod. 75, 311-335 (2012).
- Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural products as sources of new drugs over the nearly four decades from 01/1981 to 09/2019. J Nat Prod. 83 (3), 770-803 (2020).
- Kohnen-Johannsen, K., Kayser, O. Tropane alkaloids: Chemistry, pharmacology, biosynthesis and production. Molecules. 24 (4), 796 (2019).
- Shim, K. H., Kang, M. J., Sharma, N., An, S. S. A. Beauty of the beast: anticholinergic tropane alkaloids in therapeutics. Nat Prod Bioprospect. 12 (1), 33 (2022).
- Web Annex A. World Health Organization Model List of Essential Medicines – 23rd List, 2023. The Selection and Use of Essential Medicines 2023: Executive Summary of the Report of the 24th WHO Expert Committee on the Selection and Use of Essential Medicines. , 24-28 (2023).
- Kerchner, A., Farkas, A. Worldwide poisoning potential of Brugmansia and Datura. Forensic Toxicol. 38, 30-41 (2020).
- Hanna, J. P., Schmidley, J. W., Braselton, W. E. Datura delirium. Clin Neuropharmacol. 15, 109-113 (1992).
- Alexander, J., et al. Scientific opinion of the panel on contaminants in the food chain on a request from the European Commission on tropane alkaloids (from Datura sp.) as undesirable substances in animal feed. EFSA J. 691, 1-55 (2008).
- González-Gómez, L., Morante-Zarcero, S., Pérez-Quintanilla, D., Sierra, I. Occurrence and chemistry of Tropane alkaloids in foods, with a focus on sample analysis methods: A review on recent trends and technological advances. Foods. 11 (3), 407 (2022).
- Cirlini, M., Cappucci, V., Galaverna, G., Dall’Asta, C., Bruni, R. A sensitive UHPLC-ESI-MS/MS method for the determination of tropane alkaloids in herbal teas and extracts. Food Control. 105, 285-291 (2019).
- Amorim Madiera, P. J., Florencio, M. H., Prasain, J. Applications of Tandem Mass Spectrometry: From Structural Analysis to Fundamental Studies. Tandem Mass Spectrometry – Applications and Principles. , (2012).
- Xing, J., Xie, C., Lou, H. Recent applications of liquid chromatography-mass spectrometry in natural products bioanalysis. J Pharm Biomed Anal. 44 (2), 368-378 (2007).
- Negrin, A., Long, C., Motley, T. J., Kennelly, E. J. LC-MS metabolomics and chemotaxonomy of caffeine-containing holly (Ilex) species and related taxa in the Aquifoliaceae. J. Agric. Food Chem. 67 (19), 5687-5699 (2019).
- Och, A., Szewczyk, K., Pecio, L., Stochmal, A., Zaluski, D., Bogucka-Kocka, A. UPLC-MS/MS profile of alkaloids with cytotoxic properties of selected medicinal plants of the Berberidaceae and Papaveraceae families. Oxid Med Cell Longevity. 2017, 9369872 (2017).
- Li, Y., Pang, T., Shi, J., Liu, X., Deng, J., Lin, Q. Simultaneous determination of alkaloids and their related tobacco-specific nitrosamines in tobacco leaves using LC-MS-MS. J Chromatogr Sci. 53 (10), 1730-1736 (2015).
- González-Gómez, L., Morante-Zarcero, S., Pereira, J. A. M., Câmara, J. S., Sierra, I. Improved analytical approach for determination of tropane alkaloids in leafy vegetables based on µ-QuEChERS combined with HPLC-MS/MS. Toxins. 14 (10), 650 (2022).
- Cinelli, M. A., Jones, A. D. Alkaloids of the Genus Datura: Review of a rich resource for natural product discovery. Molecules. 26, 2629 (2021).
- Gonçalves Dantas, C., et al. Dereplication of tropane alkaloids from four Erythroxylum species using liquid chromatography coupled with ESI-MSn and HRESIMS. Rapid Commun Mass Spectrom. 37 (21), e9629 (2023).
- Santos, C. L. G., et al. Molecular networking-based dereplication of strictosidine-derived monoterpene indole alkaloids from the curare ingredient Strychnos peckii. Rapid Commun Mass Spectrom. 34 (3), e8683 (2020).
- Qin, G. F., et al. MS/MS-based molecular networking: An efficient approach for natural products dereplication. Molecules. 28, 157 (2023).
- Du, N., Zhou, W., Jin, H., Liu, Y., Zhou, H., Liang, X. Characterization of tropane and cinnamamide alkaloids from Scopolia tangutica by high-performance liquid chromatography with quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry. J Sep Sci. 42 (6), 1163-1173 (2019).
- Agnes, S. A., et al. Implementation of a MS/MS database for isoquinoline alkaloids and other annonaceous metabolites. Sci Data. 9 (1), 270 (2022).
- Sixto, A., Pérez-Parada, A., Niell, S., Heinzen, H. GC-MS and LC-MS/MS workflows for the identification and quantitation of pyrrolizidine alkaloids in plant extracts, a case study: Echium plantagineum. Rev Bras Farmacog. 29 (4), 500-503 (2019).
- Wang, H., Xu, X., Wang, X., Guo, W., Jia, W., Zhang, F. An analytical strategy for discovering structural analogues of alkaloids in plant food using characteristic structural fragments extraction by high resolution orbitrap mass spectrometry. LWT- Sci Technol. 154, 112329 (2022).
- Parks, H. M., et al. Redirecting tropane alkaloid metabolism reveals pyrrolidine alkaloid diversity in Atropa belladonna. New Phytol. 237 (5), 1810-1825 (2023).
- . MassBank of North America Available from: https://mona.fiehnlab.ucdavis.edu (2024)
- Maier, I., et al. Fluorodaturatin und Homofluorodaturatin – zwei neue β-carbolinderivate in Samen von Datura stramonium L. var. stramonium. Monatsh Chem. 112, 1425-1439 (1981).
- Jennett-Siems, K., et al. Chemotaxonomy of the pantropical genus Merremia (Convolvulaceae) based on the distribution of tropane alkaloids. Phytochemistry. 66, 1448-1464 (2005).
- Kohnen, K. L., Sezgin, S., Spiteller, M., Hagels, H., Kayser, O. Localization and organization of scopolamine biosynthesis in Duboisia myoporoides R. Br. Plant Cell Physiol. 59 (1), 107-118 (2018).
- Guan, P., et al. Full collision energy ramp-MS2 spectrum in structural analysis relying on MS/MS. Anal Chem. 93 (46), 15381-15389 (2021).
- Al Balkhi, M. H., Schlitz, S., Lesur, D., Lanoue, A., Wadouachi, M., Boitel-Conti, M. Norlittorine and norhyoscyamine identified as products of littorine and hyoscyamine metabolism by 13C-labeling in Datura innoxia hairy roots. Phytochemistry. 74, 105-114 (2012).
- Sumner, L. W., et al. Proposed minimum reporting standards for chemical analysis. Metabolomics. 3, 211-221 (2007).
- Gambaro, V., Labbe, C., Castillo, M. Angeloyl, Tigloyl and Senecioyloxytropane Alkaloids from Schizanthus hookerii. Phytochemistry. 22 (8), 1838-1839 (1983).
- Christen, P., Cretton, S., Humam, M., Bieri, S., Muñoz, O., Joseph-Nathan, P. Chemistry and biological activity of alkaloids from the genus Schizanthus. Phytochem Rev. 19, 615-641 (2020).
- Lounasmaa, M., Tamminen, T. The Tropane Alkaloids. The Alkaloids: Chemistry and Pharmacology. , (1993).
.