יישומים של ספקטרומטריית מסה טנדם כרומטוגרפיה נוזלית במחקר מוצרים טבעיים: אלקלואידים טרופאן כמקרה בוחן
Summary
אנו מציגים שיטה לביאור וסיווג מבוססי ספקטרומטריית מסה מהירה (MS)/ספקטרומטריית מסה (MS) של אלקלואידים טרופאניים, שימושית הן לשכפול ראשוני של דגימות המכילות טרופאן והן לגילוי אלקלואידים חדשים לבידוד.
Abstract
למרות שתרופות רבות המשמשות כיום הן סינתטיות במקורן, מוצרים טבעיים עדיין מספקים מקור עשיר למגוון כימי חדש ולפעילות ביולוגית, ויכולים להניב לידים מבטיחים למחלות עמידות או מתפתחות. האתגר, עם זאת, הוא כפול: לא רק שעל החוקרים למצוא תוצרים טבעיים ולהבהיר את המבנים שלהם, אלא עליהם גם לזהות מה כדאי לבודד ולבדוק (ומה שכבר ידוע – תהליך המכונה dereplication). עם הופעתו של מכשור אנליטי מודרני, קצב הגילוי והשכפול של מוצרים טבעיים הואץ. ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית טנדם (LC-MS/MS) הפכה לטכניקה בעלת ערך רב במיוחד לזיהוי וסיווג מבנים כימיים. אלקלואידים טרופאן (TAs) הם תרכובות צמחיות בעלות חשיבות רפואית וטוקסיקולוגית רבה. במחקר זה, פיתחנו זרימת עבודה של סינון מבוססת LC-MS/MS תוך שימוש בתצורות MS/MS המרובות הזמינות בספקטרומטר מסות משולש מרובע (QQQ) כדי להוסיף הערות ולסווג מבני TA בהתבסס על דפוסי הפיצול הייחודיים שלהם. על ידי שימוש בשילוב של סריקות יוני מוצר תלויות נתונים (DD), סריקות יונים מקדימות (PrIS) וסריקות אובדן ניטרליות (NLS), יישמנו שיטה זו על תמציות עשירות בת”א של הסוליות Datura stramonium ו – Datura metel. שיטה זו היא מהירה, רגישה, ושימשה בהצלחה הן לשכפול ראשוני של דגימות מורכבות המכילות TA והן לגילוי מועמד חדש לבידוד, טיהור (ובסופו של דבר ביו-אסיה).
Introduction
אף על פי שמולקולות סינתטיות לחלוטין הפכו לבולטות יותר בגילוי תרופות בעשורים האחרונים, כמעט שני שלישים מכל התרופות שאושרו ב-39 השנים האחרונות הן מוצרים טבעיים או בהשראת מוצרים טבעיים,1,2 מה שמדגיש את החשיבות המתמשכת של מחקר מוצרים טבעיים. אלקלואידים, מוצרים טבעיים מסוימים המכילים חנקן, מוערכים במיוחד בזכות תכונותיהם הרפואיות. אלקלואידים טרופאן (TAs) המכילים את [3.2.1.]- מערכת דו-גלגלית המכילה חנקן, מיוצרת בעיקר על ידי צמחים ממשפחות הסולניים (סולניים), אריתרוקסילאיים (Erythroxylaceae) וקונבולוולוסיים (Convolvulaceae). דוגמאות כוללות אטרופין, סקופולמין וקוקאין; מספר טרופיות חצי סינתטיות או סינתטיות משמשות גם מבחינה קלינית3. TAs ונגזרותיהם משמשים לטיפול במצבים רבים 3,4 וכמה מתרופות אלה מופיעות ברשימת התרופות החיוניות5 של ארגון הבריאות העולמי לשנת 2023. בשל פעילותם רבת העוצמה, TAs משמשים גם לשעות הפנאי (כממריצים או מדלירים) ועלולים לגרום להרעלה בבליעה של צמחים (או תכשירים) המכילים אותם 6,7. TAs אינם רצויים במזון לבני אדם ובעלי חיים8 ויכולים להכתים תה, תבלינים, דגנים, דבש ותוספי צמחים 9,10. הן בשל ההבטחה הרפואית שלהן והן בשל יכולתן להרעיל, שיטות אנליטיות שיכולות לסייע בגילוי TAs חדשים (וזיהוי של TAs ידועים) הן שימושיות.
בספקטרומטריית מסות מקבילה (MS/MS), “מסנני מסה” (למשל, קוואדרופולים, צינורות זמן טיסה) מחוברים זה לזה פיזית (“בחלל”), או שמכשיר מפעיל צעדי תגובה/הפרדה נוספים “בזמן”. MS/MS בחלל משתמש במצבים שונים כדי לבחור ולפרק יונים שונים במסנני המסה השונים (למשל, הקוואדרופולים של מכשיר משולש-מרובע או מכשיר QQQ). ניתן להשתמש במצבים שונים אלה כדי לקבוע אילו מקטעים ספציפיים מיוצרים על ידי יון נתון (סריקת יוני מוצר), אילו יונים בדגימה מניבים מקטעים מסוימים (סריקת יונים מקדימים או PrIS) או עוברים אובדן של מסה אופיינית (סריקת אובדן נייטרלי או NLS), או אילו תרכובות ספציפיות מכילות אילו מקטעים ספציפיים (ניטור תגובה מרובה). MS/MS, אם כן, מספק מקטעים שימושיים להצעת מבנים לתרכובות חדשות או לאישור נוכחותה של תרכובת קיימת. MS/MS נמצא בשימוש הולך וגובר בגילוי תרופות, כימיה של מוצרים טבעיים ושדות מטבולומיים 11,12, ושימש לפרופיל מינים המכילים אלקלואידים (לאפיון פיטוכימי או ניתוח כימוטקסונומי) ולזיהוי וכימות אלקלואידים ספציפיים במזון או בצמחי מרפא 10,13,14,15,16.
למרות טכניקות ספקטרומטריית המסות הרבות הזמינות, ישנם אתגרים במציאת אלקלואידים חדשים. בנוסף למציאת אורגניזם מועמד לסינון, אישור מבני מלא של אלקלואיד הוא תהליך מפרך שעשוי לכלול טכניקות אנליטיות רבות ושונות. בנוסף, החוקרים יוכלו לבודד תרכובת שכבר ידועה, תוך בזבוז עבודה, זמן ומשאבים. הדבר קשה במיוחד עבור ת”א, שם מדווחים על מאות, אם לא אלפי ת”א, שרבים מהם איזומריים זה עם זה. התהליך של “זיהוי הידועים והבדילתם מן הנעלמים” מכונה שכפול. מאגרי מידע של זמני השמירה (r.t.s) ושברי מסה של TAs שונים ותרכובות אחרות מתפרסמים כדי לסייע בתהליך זה17,18. אף על פי כן, השכפול מייגע; רק ביאור (כלומר, הקצאת מבנים משוערים) לאלקלואידים בכל כרומטוגרמה LC-MS/MS של הדגימה גוזל זמן. לאחרונה, הן רשת מולקולרית1 9,20 והן שכפול ידני 18,21,22 שימשו עבור אלקלואידים של בנזיליסוקינולין, אינדול מונוטרפן וטרופאן, ו-PrISs שימשו ל”סינון מבני” של ספקטרום לזיהוי אלקלואידים מסוג פירוליזידין וסולנין 23,24. עם זאת, אין שיטות או זרימות עבודה ספציפיות זמינות לשכפול מהיר מבוסס LC-MS/MS של דגימות המכילות TA, אף על פי שלדגימות TA יש מקטעים נפוצים וקלים לזיהוי (איור 1). השיטה המתוארת כאן משתמשת בשילוב של סריקות יוני תוצר תלויי נתונים (DD), PrISs ו-NLSs כדי לבאר ולסווג מבני TA בצמחים בהתבסס הן על תבניות הפיצול הנפרדות של טרופאנים מונו, די ותלת-תחליפים (איור 1A) והן על ההפסדים של קבוצות אסטר נפוצות שנמצאו בלקלואידים האלה (איור 1B). יצורי המחקר הם כמה מינים בסוג הסולת Datura. מקור עשיר של TAs מגוונים, Datura שימש לאורך ההיסטוריה של העולם למטרות רפואיות ותרבותיות17 – והוא מטריצה מאתגרת לשכפול בגלל TAs רבים, דומים מבחינה מבנית, המספקים לנו דוגמאות מושכות שעליהן ניתן לבחון את השיטה שלנו.
Protocol
Representative Results
Discussion
למרות שהפרמטרים של המכשיר המסופקים בפרוטוקול מאפשרים ביצועים משביעי רצון, השימוש המוצלח בשיטה זו עשוי לדרוש תשומת לב קפדנית או אופטימיזציה של מספר שלבים קריטיים. בעוד ששיפוע הממס HPLC המסופק בשלב 2.2 מתאים בדרך כלל לאלקלואידים טרופניים, ייתכן שיהיה צורך לשנות אותו בהתאם ל?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי מענק מחקר פקולטי (אוניברסיטת צפון מישיגן, הוענק ל- M.A.C.), מלגת מחקר לתואר ראשון (אוניברסיטת צפון מישיגן, הוענקה ל- J.C) והמחלקה לכימיה. המחברים רוצים להודות לג’ון ברגר (NMU) על הסיוע בהכנת רקמות צמחים, לחנה הוקינס (NMU) על התחזוקה של LC-MS ולסיוע בפתרון בעיות, ולד”ר ריאן פורנוולד ותלמידיו CH 495 (סינתזת מוצרים טבעיים) על הכנת תערובת אצטילטרופין. המחברים מבקשים גם להודות לד”ר דניאל ג’ונס (אוניברסיטת מישיגן) על רכישת ספקטרום MS/MS ברזולוציה גבוהה.
Materials
| Acetonitrile, For UHPLC, suitable for mass spectometry | Sigma-Aldrich | 900667 | HPLC solvent |
| Argon gas | AirGas | AR UHP300 | CID gas |
| Formic acid, 99% for analysis | Thermo Scientific | AC270480010 | HPLC additive |
| Guard column holder | Restek | 25812 | |
| HPLC, Shimadzu LC-2030C 3D Plus | Shimadzu | 228-65802-58 | HPLC column |
| LCMS, Shimdazu LCMS-8045 | Shimadzu | 225-31800-44 | Mass spectrometer; we ran LabSolutions software, which is standard for Shimadzu instruments |
| Liquid nitrogen | AirGas | NI 180LT22 | |
| Methanol, for HPLC/UHPLC/LCMS | VWR | BDH 85800.400 | For making extraction solvent |
| Microcentrifuge | VWR | 2400-37 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Mortar | Fisher Scientific | FB961C | For grinding plant tissues |
| Pestle | Fisher Scientific | FB961M | For grinding plant tissues |
| Pipette 1000 mL | Gilson | F144059M | |
| Pipette tip 1000 mL | Fisher scientific | 02-707-404 | |
| Plant tissues | Various sources | N/A | Can be anything wild or cultivated |
| Polypropylene conical tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-539-4 | |
| Polystyrene cooler | ULINE | S-18312 | The type of coolers that reagents for molecular biology are shipped in would be appropriate |
| Roc C18 3 µm, 100 mm x 4.6 mm | Restek | 9534315 | HPLC column |
| Roc C18, 10 mm x 4 mm | Restek | 953450210 | Guard column |
| Rocking shaker | Themo Scientific | 11-676-680 | |
| Screw thread vial convenience kit (9 mm) | Fisher scientific | 13-622-190 | LCMS autosampler vials |
| Syringe, 3 mL | Fisher Scientific | 03-377-27 | |
| Syringe filter 0.45 µm | Avantor/VWR | 76479-008 | |
| Water, for use in liquid chromatography and mass spectrometry | JT Baker | 9831-03 | For making extraction solvent |
| Water solution, contains 0.1% v/v formic acid, For UHPLC, suitable for mass spectometry | Sigma-Aldrich | 900687-1L | HPLC solvent |
References
- Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural products as sources of new drugs over the 30 years from 1981 to 2010. J Nat Prod. 75, 311-335 (2012).
- Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural products as sources of new drugs over the nearly four decades from 01/1981 to 09/2019. J Nat Prod. 83 (3), 770-803 (2020).
- Kohnen-Johannsen, K., Kayser, O. Tropane alkaloids: Chemistry, pharmacology, biosynthesis and production. Molecules. 24 (4), 796 (2019).
- Shim, K. H., Kang, M. J., Sharma, N., An, S. S. A. Beauty of the beast: anticholinergic tropane alkaloids in therapeutics. Nat Prod Bioprospect. 12 (1), 33 (2022).
- Web Annex A. World Health Organization Model List of Essential Medicines – 23rd List, 2023. The Selection and Use of Essential Medicines 2023: Executive Summary of the Report of the 24th WHO Expert Committee on the Selection and Use of Essential Medicines. , 24-28 (2023).
- Kerchner, A., Farkas, A. Worldwide poisoning potential of Brugmansia and Datura. Forensic Toxicol. 38, 30-41 (2020).
- Hanna, J. P., Schmidley, J. W., Braselton, W. E. Datura delirium. Clin Neuropharmacol. 15, 109-113 (1992).
- Alexander, J., et al. Scientific opinion of the panel on contaminants in the food chain on a request from the European Commission on tropane alkaloids (from Datura sp.) as undesirable substances in animal feed. EFSA J. 691, 1-55 (2008).
- González-Gómez, L., Morante-Zarcero, S., Pérez-Quintanilla, D., Sierra, I. Occurrence and chemistry of Tropane alkaloids in foods, with a focus on sample analysis methods: A review on recent trends and technological advances. Foods. 11 (3), 407 (2022).
- Cirlini, M., Cappucci, V., Galaverna, G., Dall’Asta, C., Bruni, R. A sensitive UHPLC-ESI-MS/MS method for the determination of tropane alkaloids in herbal teas and extracts. Food Control. 105, 285-291 (2019).
- Amorim Madiera, P. J., Florencio, M. H., Prasain, J. Applications of Tandem Mass Spectrometry: From Structural Analysis to Fundamental Studies. Tandem Mass Spectrometry – Applications and Principles. , (2012).
- Xing, J., Xie, C., Lou, H. Recent applications of liquid chromatography-mass spectrometry in natural products bioanalysis. J Pharm Biomed Anal. 44 (2), 368-378 (2007).
- Negrin, A., Long, C., Motley, T. J., Kennelly, E. J. LC-MS metabolomics and chemotaxonomy of caffeine-containing holly (Ilex) species and related taxa in the Aquifoliaceae. J. Agric. Food Chem. 67 (19), 5687-5699 (2019).
- Och, A., Szewczyk, K., Pecio, L., Stochmal, A., Zaluski, D., Bogucka-Kocka, A. UPLC-MS/MS profile of alkaloids with cytotoxic properties of selected medicinal plants of the Berberidaceae and Papaveraceae families. Oxid Med Cell Longevity. 2017, 9369872 (2017).
- Li, Y., Pang, T., Shi, J., Liu, X., Deng, J., Lin, Q. Simultaneous determination of alkaloids and their related tobacco-specific nitrosamines in tobacco leaves using LC-MS-MS. J Chromatogr Sci. 53 (10), 1730-1736 (2015).
- González-Gómez, L., Morante-Zarcero, S., Pereira, J. A. M., Câmara, J. S., Sierra, I. Improved analytical approach for determination of tropane alkaloids in leafy vegetables based on µ-QuEChERS combined with HPLC-MS/MS. Toxins. 14 (10), 650 (2022).
- Cinelli, M. A., Jones, A. D. Alkaloids of the Genus Datura: Review of a rich resource for natural product discovery. Molecules. 26, 2629 (2021).
- Gonçalves Dantas, C., et al. Dereplication of tropane alkaloids from four Erythroxylum species using liquid chromatography coupled with ESI-MSn and HRESIMS. Rapid Commun Mass Spectrom. 37 (21), e9629 (2023).
- Santos, C. L. G., et al. Molecular networking-based dereplication of strictosidine-derived monoterpene indole alkaloids from the curare ingredient Strychnos peckii. Rapid Commun Mass Spectrom. 34 (3), e8683 (2020).
- Qin, G. F., et al. MS/MS-based molecular networking: An efficient approach for natural products dereplication. Molecules. 28, 157 (2023).
- Du, N., Zhou, W., Jin, H., Liu, Y., Zhou, H., Liang, X. Characterization of tropane and cinnamamide alkaloids from Scopolia tangutica by high-performance liquid chromatography with quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry. J Sep Sci. 42 (6), 1163-1173 (2019).
- Agnes, S. A., et al. Implementation of a MS/MS database for isoquinoline alkaloids and other annonaceous metabolites. Sci Data. 9 (1), 270 (2022).
- Sixto, A., Pérez-Parada, A., Niell, S., Heinzen, H. GC-MS and LC-MS/MS workflows for the identification and quantitation of pyrrolizidine alkaloids in plant extracts, a case study: Echium plantagineum. Rev Bras Farmacog. 29 (4), 500-503 (2019).
- Wang, H., Xu, X., Wang, X., Guo, W., Jia, W., Zhang, F. An analytical strategy for discovering structural analogues of alkaloids in plant food using characteristic structural fragments extraction by high resolution orbitrap mass spectrometry. LWT- Sci Technol. 154, 112329 (2022).
- Parks, H. M., et al. Redirecting tropane alkaloid metabolism reveals pyrrolidine alkaloid diversity in Atropa belladonna. New Phytol. 237 (5), 1810-1825 (2023).
- . MassBank of North America Available from: https://mona.fiehnlab.ucdavis.edu (2024)
- Maier, I., et al. Fluorodaturatin und Homofluorodaturatin – zwei neue β-carbolinderivate in Samen von Datura stramonium L. var. stramonium. Monatsh Chem. 112, 1425-1439 (1981).
- Jennett-Siems, K., et al. Chemotaxonomy of the pantropical genus Merremia (Convolvulaceae) based on the distribution of tropane alkaloids. Phytochemistry. 66, 1448-1464 (2005).
- Kohnen, K. L., Sezgin, S., Spiteller, M., Hagels, H., Kayser, O. Localization and organization of scopolamine biosynthesis in Duboisia myoporoides R. Br. Plant Cell Physiol. 59 (1), 107-118 (2018).
- Guan, P., et al. Full collision energy ramp-MS2 spectrum in structural analysis relying on MS/MS. Anal Chem. 93 (46), 15381-15389 (2021).
- Al Balkhi, M. H., Schlitz, S., Lesur, D., Lanoue, A., Wadouachi, M., Boitel-Conti, M. Norlittorine and norhyoscyamine identified as products of littorine and hyoscyamine metabolism by 13C-labeling in Datura innoxia hairy roots. Phytochemistry. 74, 105-114 (2012).
- Sumner, L. W., et al. Proposed minimum reporting standards for chemical analysis. Metabolomics. 3, 211-221 (2007).
- Gambaro, V., Labbe, C., Castillo, M. Angeloyl, Tigloyl and Senecioyloxytropane Alkaloids from Schizanthus hookerii. Phytochemistry. 22 (8), 1838-1839 (1983).
- Christen, P., Cretton, S., Humam, M., Bieri, S., Muñoz, O., Joseph-Nathan, P. Chemistry and biological activity of alkaloids from the genus Schizanthus. Phytochem Rev. 19, 615-641 (2020).
- Lounasmaa, M., Tamminen, T. The Tropane Alkaloids. The Alkaloids: Chemistry and Pharmacology. , (1993).
.