Toepassingen van vloeistofchromatografie tandem massaspectrometrie in onderzoek naar natuurlijke producten: tropaanalkaloïden als casestudy

Hoewel volledig synthetische moleculen de afgelopen decennia een prominentere plaats hebben gekregen bij de ontdekking van geneesmiddelen, is bijna tweederde van alle goedgekeurde geneesmiddelen van de afgelopen 39 jaar natuurlijke producten of geïnspireerd op natuurlijke ^{producten,1,2}  wat het voortdurende belang van onderzoek naar natuurlijke producten onderstreept. Alkaloïden, bepaalde stikstofhoudende natuurproducten, worden vooral gewaardeerd om hun geneeskrachtige eigenschappen. Tropaanalkaloïden (TA’s) die de [3.2.1.]-bicyclisch stikstofhoudend systeem, worden voornamelijk geproduceerd door planten in de families Solanaceae (nachtschade), Erythroxylaceae en Convolvulaceae. Voorbeelden zijn atropine, scopolamine en cocaïne; Meerdere semi-synthetische of synthetische tropaanen worden ook klinisch gebruikt³. TA’s en hun derivaten worden gebruikt om veel aandoeningen te behandelen ^3,4 en verschillende van deze geneesmiddelen staan op de WHO-lijst van^{essentiële geneesmiddelen} 2023 5. Vanwege hun krachtige activiteiten worden TA’s ook recreatief gebruikt (als stimulerende middelen of delirianten) en kunnen ze vergiftiging veroorzaken bij inname van planten (of preparaten) die ze bevatten ^6,7. TA’s zijn ongewenst in menselijke en dierlijke voeding⁸ en kunnen thee, kruiden, granen, honing en kruidensupplementen aantasten ^9,10. Vanwege zowel hun medicinale belofte als hun vermogen om te vergiftigen, zijn analytische methoden die kunnen helpen bij de ontdekking van nieuwe TA’s (en identificatie van bekende TA’s) nuttig.

Bij tandem massaspectrometrie (MS/MS) worden “massafilters” (bijv. quadrupolen, time-of-flight-buizen) fysiek aan elkaar gekoppeld (“in-space”), of maakt een instrument gebruik van extra “in-time” reactie-/scheidingsstappen. In-space MS/MS gebruikt verschillende modi om verschillende ionen te selecteren en te fragmenteren bij de verschillende massafilters (bijv. de quadrupolen van een triple-quadrupool of QQQ-instrument). Deze verschillende modi kunnen worden gebruikt om te bepalen welke specifieke fragmenten door een bepaald ion worden gemaakt (productionenscan), welke ionen in een monster bepaalde fragmenten opleveren (precursor ionenscan of PrIS) of verliezen van een karakteristieke massa ondergaan (neutral loss scan of NLS), of welke specifieke verbindingen welke specifieke fragmenten bezitten (monitoring van meervoudige reacties). MS/MS levert daarom fragmenten die nuttig zijn voor het voorstellen van structuren voor nieuwe verbindingen of het bevestigen van de aanwezigheid van een bestaande verbinding. MS/MS wordt steeds vaker gebruikt op het gebied van geneesmiddelenontdekking, chemie van natuurlijke producten en metabolomics ^11,12, en is gebruikt om alkaloïde-bevattende soorten te profileren (voor fytochemische karakterisering of chemotaxonomische analyse) en om specifieke alkaloïden in voedsel of geneeskrachtige planten te detecteren en te kwantificeren 10,13,14,15,16.

Ondanks de vele massaspectrometrietechnieken die beschikbaar zijn, zijn er uitdagingen bij het vinden van nieuwe alkaloïden. Naast het vinden van een kandidaat-organisme om te screenen, is een volledige structurele bevestiging van een alkaloïde een moeizaam proces dat veel verschillende analytische technieken kan omvatten. Bovendien kunnen onderzoekers een verbinding isoleren die al bekend is, waardoor arbeid, tijd en middelen worden verspild. Dit is vooral moeilijk voor TA’s, waar honderden, zo niet duizenden TA’s, waarvan er vele isomeer met elkaar zijn, worden gerapporteerd. Het proces van “het identificeren van de bekenden en het onderscheiden van de onbekenden” staat bekend als dereplicatie. Databases van de retentietijden (r.t.s) en massafragmenten van verschillende TA’s en andere verbindingen worden gepubliceerd om te helpen bij dit proces^17,18. Desalniettemin is dereplicatie arbeidsintensief; alleen het annoteren (d.w.z. toekennen van vermeende structuren aan) de alkaloïden in het gehele LC-MS/MS-chromatogram van een monster is tijdrovend. Onlangs zijn zowel moleculaire netwerken^{1 9,20} als handmatige dereplicatie 18,21,22 gebruikt voor benzylisoquinoline, monoterpeenindool en tropaanalkaloïden, en PrIS’s zijn gebruikt voor “structurele filtering” van spectra om pyrrolizidine en solanine-type alkaloïden te identificeren ^23,24. Er zijn echter geen specifieke methoden of workflows beschikbaar voor snelle LC-MS/MS-gebaseerde dereplicatie van TA-bevattende monsters, ook al bevatten TA’s gewone, gemakkelijk identificeerbare fragmenten (Figuur 1). De hier beschreven methode maakt gebruik van een combinatie van data-afhankelijke (DD) productionenscans, PrIS’s en NLS’s om TA-structuren in planten te annoteren en te classificeren op basis van zowel de verschillende fragmentatiepatronen voor mono-, di- en trigesubstitueerde tropapen (Figuur 1A) als de verliezen van gemeenschappelijke estergroepen die in deze alkaloïden worden aangetroffen (Figuur 1B). De studie-organismen zijn verschillende soorten in het nachtschadegeslacht Datura. Datura, een rijke bron van diverse TA’s, is door de hele geschiedenis heen gebruikt voor medicinale en culturele doeleinden¹⁷– en is een uitdagende matrix om te depliceren vanwege de talrijke, structureel vergelijkbare TA’s, die ons aantrekkelijke voorbeelden bieden waarop we onze methode kunnen testen.