Применение тандемной масс-спектрометрии с помощью жидкостной хроматографии в исследованиях природных продуктов: тропановые алкалоиды на примере
Summary
Мы представляем метод быстрой масс-спектрометрии (МС)/масс-спектрометрии (МС) аннотации и классификации тропановых алкалоидов, полезный как для предварительной дерепликации образцов, содержащих тропан, так и для обнаружения новых алкалоидов для выделения.
Abstract
Несмотря на то, что многие лекарства, используемые сегодня, имеют синтетическое происхождение, натуральные продукты по-прежнему являются богатым источником нового химического разнообразия и биологической активности, а также могут дать многообещающие результаты в борьбе с устойчивыми или новыми заболеваниями. Проблема, однако, двоякая: исследователи должны не только найти натуральные продукты и выяснить их структуру, но и определить, что стоит выделить и проанализировать (и что уже известно – процесс, известный как дерепликация). С появлением современных аналитических приборов темпы обнаружения и дерепликации натуральных продуктов ускорились. Жидкостная хроматография-тандемная масс-спектрометрия (ЖХ-МС/МС) стала особенно ценным методом для идентификации и классификации химических структур. Тропановые алкалоиды (ТА) являются соединениями растительного происхождения, имеющими большое медицинское и токсикологическое значение. В этом исследовании мы разработали процесс скрининга на основе LC-MS/MS, используя несколько конфигураций MS/MS, доступных на тройном квадрупольном масс-спектрометре (QQQ), для аннотирования и классификации структур TA на основе их различных паттернов фрагментации. Используя комбинацию сканирования ионов, зависящих от данных (DD), сканирования ионов-предшественников (PrIS) и сканирования нейтральных потерь (NLS), мы применили этот метод к богатым TA экстрактам пасленовых Datura stramonium и Datura metel. Этот метод является быстрым, чувствительным и был успешно использован как для предварительной дерепликации сложных образцов, содержащих ТА, так и для открытия нового кандидата для выделения, очистки (и последующего биоанализа).
Introduction
Несмотря на то, что в последние десятилетия полностью синтетические молекулы стали играть все более заметную роль в разработке лекарств, почти две трети всех одобренных лекарств за последние 39 лет являются натуральными продуктами или продуктами, вдохновленными натуральными продуктами,1,2 что подчеркивает сохраняющуюся важность исследований в области натуральных продуктов. Алкалоиды, некоторые азотсодержащие природные продукты, особенно ценятся за свои лечебные свойства. Тропановые алкалоиды (ТА), содержащие [3.2.1.]-бициклические азотсодержащие системы, продуцируются в основном растениями семейств Пасленовые, Эритроксиловые и Вьюнковые (Convolvulaceae). Примеры включают атропин, скополамин и кокаин; Многократные полусинтетические или синтетические тропаны также используются в клинической практике3. ТА и их производные используются для лечения многих состояний 3,4, и некоторые из этих препаратов включены в Список основных лекарственных средств ВОЗ на 2023 год5. Из-за своей мощной активности ТК также используются в рекреационных целях (в качестве стимуляторов или делириантов) и могут вызвать отравление при употреблении в пищу растений (или препаратов), которые их содержат 6,7. ТК нежелательны в пище человека и животных8 и могут испортить чаи, специи, зерновые, мед и травяные добавки 9,10. Из-за их лечебных возможностей и способности отравлять, аналитические методы, которые могут помочь в открытии новых ТА (и идентификации известных ТА), являются полезными.
В тандемной масс-спектрометрии (МС/МС) «масс-фильтры» (например, квадруполи, времяпролетные трубки) физически связаны друг с другом («в космосе»), или в приборе используются дополнительные «временные» этапы реакции/разделения. В космосе МС/МС использует различные режимы для отбора и фрагментации различных ионов на различных массовых фильтрах (например, квадруполях тройного квадруполя или инструмента QQQ). Эти различные режимы могут использоваться для определения того, какие конкретные фрагменты образуются данным ионом (сканирование ионов продукта), какие ионы в образце дают определенные фрагменты (сканирование ионов-предшественников или PrIS) или претерпевают потери характерной массы (сканирование нейтральными потерями или NLS), или какие конкретные соединения обладают какими конкретными фрагментами (мониторинг множественных реакций). Таким образом, MS/MS предоставляет фрагменты, которые полезны для предложения структур для новых соединений или подтверждения присутствия существующего соединения. МС/МС все чаще используется в области разработки лекарственных препаратов, химии природных продуктов и метаболомики 11,12, а также используется для профилирования веществ, содержащих алкалоиды (для фитохимической характеристики или хемотаксономического анализа), а также для обнаружения и количественного определения специфических алкалоидов в пищевых или лекарственных растениях 10,13,14,15,16.
Несмотря на множество доступных методов масс-спектрометрии, существуют проблемы с поиском новых алкалоидов. В дополнение к поиску организма-кандидата для скрининга, полное структурное подтверждение алкалоида является трудоемким процессом, который может включать в себя множество различных аналитических методов. Кроме того, исследователи могут изолировать соединение, которое уже известно, тратя впустую труд, время и ресурсы. Это особенно сложно для ТА, где регистрируются сотни, если не тысячи ТА, многие из которых изомерны друг другу. Процесс «идентификации известного и отличия его от неизвестного» известен как дерепликация. Для помощи в этом процессе публикуются базы данных о времени удержания (r.t.s) и массовых фрагментах различных TA и других соединений17,18. Тем не менее, дерепликация трудоемка; простое аннотирование (т.е. присвоение предполагаемых структур) алкалоидов во всей хроматограмме LC-MS/MS образца занимает много времени. В последнее время для бензилизохинолина, монотерпена индола и тропановых алкалоидов были использованы как молекулярная сеть1 9,20, так и ручная дерепликация 18,21,22. Тем не менее, не существует специальных методов или рабочих процессов, доступных для быстрой дерепликации образцов, содержащих ТА, на основе ЖХ-МС/МС, даже несмотря на то, что ТА обладают общими, легко идентифицируемыми фрагментами (рис. 1). В описанном здесь методе используется комбинация зависящих от данных (DD) сканирования ионов продуктов, PrIS и NLS для аннотирования и классификации структур TA в растениях на основе как различных структур фрагментации моно-, ди- и тризамещенных тропанов (рисунок 1A), так и потерь общих эфирных групп, обнаруженных в этих алкалоидах (рисунок 1B). Исследуемыми организмами являются несколько видов пасленовых рода Datura. Богатый источник разнообразных ТА, дурман использовался на протяжении всей мировой истории в медицинских икультурных целях, и его трудно воспроизвести из-за его многочисленных, структурно схожих ТА, что дает нам привлекательные образцы для тестирования нашего метода.
Protocol
Representative Results
Discussion
Несмотря на то, что параметры прибора, представленные в протоколе, позволяют обеспечить удовлетворительную производительность, успешное использование этого метода может потребовать тщательного внимания или оптимизации нескольких критических этапов. Хотя градиент…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была профинансирована за счет исследовательского гранта факультета (Университет Северного Мичигана, присужденный M.A.C.), исследовательской стипендии для студентов (Университет Северного Мичигана, присужден J.C.) и факультета химии. Авторы хотели бы поблагодарить Джона Бергера (NMU) за помощь в подготовке растительных тканей, Ханну Хокинс (NMU) за обслуживание LC-MS и помощь в устранении неполадок, а также доктора Райана Форнвальда и его студентов CH 495 (Синтез натуральных продуктов) за приготовление ацетилтропиновой смеси. Авторы также выражают благодарность доктору Дэниелу Джонсу (Университет штата Мичиган) за получение спектров MS/MS с высоким разрешением.
Materials
| Acetonitrile, For UHPLC, suitable for mass spectometry | Sigma-Aldrich | 900667 | HPLC solvent |
| Argon gas | AirGas | AR UHP300 | CID gas |
| Formic acid, 99% for analysis | Thermo Scientific | AC270480010 | HPLC additive |
| Guard column holder | Restek | 25812 | |
| HPLC, Shimadzu LC-2030C 3D Plus | Shimadzu | 228-65802-58 | HPLC column |
| LCMS, Shimdazu LCMS-8045 | Shimadzu | 225-31800-44 | Mass spectrometer; we ran LabSolutions software, which is standard for Shimadzu instruments |
| Liquid nitrogen | AirGas | NI 180LT22 | |
| Methanol, for HPLC/UHPLC/LCMS | VWR | BDH 85800.400 | For making extraction solvent |
| Microcentrifuge | VWR | 2400-37 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Mortar | Fisher Scientific | FB961C | For grinding plant tissues |
| Pestle | Fisher Scientific | FB961M | For grinding plant tissues |
| Pipette 1000 mL | Gilson | F144059M | |
| Pipette tip 1000 mL | Fisher scientific | 02-707-404 | |
| Plant tissues | Various sources | N/A | Can be anything wild or cultivated |
| Polypropylene conical tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-539-4 | |
| Polystyrene cooler | ULINE | S-18312 | The type of coolers that reagents for molecular biology are shipped in would be appropriate |
| Roc C18 3 µm, 100 mm x 4.6 mm | Restek | 9534315 | HPLC column |
| Roc C18, 10 mm x 4 mm | Restek | 953450210 | Guard column |
| Rocking shaker | Themo Scientific | 11-676-680 | |
| Screw thread vial convenience kit (9 mm) | Fisher scientific | 13-622-190 | LCMS autosampler vials |
| Syringe, 3 mL | Fisher Scientific | 03-377-27 | |
| Syringe filter 0.45 µm | Avantor/VWR | 76479-008 | |
| Water, for use in liquid chromatography and mass spectrometry | JT Baker | 9831-03 | For making extraction solvent |
| Water solution, contains 0.1% v/v formic acid, For UHPLC, suitable for mass spectometry | Sigma-Aldrich | 900687-1L | HPLC solvent |
References
- Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural products as sources of new drugs over the 30 years from 1981 to 2010. J Nat Prod. 75, 311-335 (2012).
- Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural products as sources of new drugs over the nearly four decades from 01/1981 to 09/2019. J Nat Prod. 83 (3), 770-803 (2020).
- Kohnen-Johannsen, K., Kayser, O. Tropane alkaloids: Chemistry, pharmacology, biosynthesis and production. Molecules. 24 (4), 796 (2019).
- Shim, K. H., Kang, M. J., Sharma, N., An, S. S. A. Beauty of the beast: anticholinergic tropane alkaloids in therapeutics. Nat Prod Bioprospect. 12 (1), 33 (2022).
- Web Annex A. World Health Organization Model List of Essential Medicines – 23rd List, 2023. The Selection and Use of Essential Medicines 2023: Executive Summary of the Report of the 24th WHO Expert Committee on the Selection and Use of Essential Medicines. , 24-28 (2023).
- Kerchner, A., Farkas, A. Worldwide poisoning potential of Brugmansia and Datura. Forensic Toxicol. 38, 30-41 (2020).
- Hanna, J. P., Schmidley, J. W., Braselton, W. E. Datura delirium. Clin Neuropharmacol. 15, 109-113 (1992).
- Alexander, J., et al. Scientific opinion of the panel on contaminants in the food chain on a request from the European Commission on tropane alkaloids (from Datura sp.) as undesirable substances in animal feed. EFSA J. 691, 1-55 (2008).
- González-Gómez, L., Morante-Zarcero, S., Pérez-Quintanilla, D., Sierra, I. Occurrence and chemistry of Tropane alkaloids in foods, with a focus on sample analysis methods: A review on recent trends and technological advances. Foods. 11 (3), 407 (2022).
- Cirlini, M., Cappucci, V., Galaverna, G., Dall’Asta, C., Bruni, R. A sensitive UHPLC-ESI-MS/MS method for the determination of tropane alkaloids in herbal teas and extracts. Food Control. 105, 285-291 (2019).
- Amorim Madiera, P. J., Florencio, M. H., Prasain, J. Applications of Tandem Mass Spectrometry: From Structural Analysis to Fundamental Studies. Tandem Mass Spectrometry – Applications and Principles. , (2012).
- Xing, J., Xie, C., Lou, H. Recent applications of liquid chromatography-mass spectrometry in natural products bioanalysis. J Pharm Biomed Anal. 44 (2), 368-378 (2007).
- Negrin, A., Long, C., Motley, T. J., Kennelly, E. J. LC-MS metabolomics and chemotaxonomy of caffeine-containing holly (Ilex) species and related taxa in the Aquifoliaceae. J. Agric. Food Chem. 67 (19), 5687-5699 (2019).
- Och, A., Szewczyk, K., Pecio, L., Stochmal, A., Zaluski, D., Bogucka-Kocka, A. UPLC-MS/MS profile of alkaloids with cytotoxic properties of selected medicinal plants of the Berberidaceae and Papaveraceae families. Oxid Med Cell Longevity. 2017, 9369872 (2017).
- Li, Y., Pang, T., Shi, J., Liu, X., Deng, J., Lin, Q. Simultaneous determination of alkaloids and their related tobacco-specific nitrosamines in tobacco leaves using LC-MS-MS. J Chromatogr Sci. 53 (10), 1730-1736 (2015).
- González-Gómez, L., Morante-Zarcero, S., Pereira, J. A. M., Câmara, J. S., Sierra, I. Improved analytical approach for determination of tropane alkaloids in leafy vegetables based on µ-QuEChERS combined with HPLC-MS/MS. Toxins. 14 (10), 650 (2022).
- Cinelli, M. A., Jones, A. D. Alkaloids of the Genus Datura: Review of a rich resource for natural product discovery. Molecules. 26, 2629 (2021).
- Gonçalves Dantas, C., et al. Dereplication of tropane alkaloids from four Erythroxylum species using liquid chromatography coupled with ESI-MSn and HRESIMS. Rapid Commun Mass Spectrom. 37 (21), e9629 (2023).
- Santos, C. L. G., et al. Molecular networking-based dereplication of strictosidine-derived monoterpene indole alkaloids from the curare ingredient Strychnos peckii. Rapid Commun Mass Spectrom. 34 (3), e8683 (2020).
- Qin, G. F., et al. MS/MS-based molecular networking: An efficient approach for natural products dereplication. Molecules. 28, 157 (2023).
- Du, N., Zhou, W., Jin, H., Liu, Y., Zhou, H., Liang, X. Characterization of tropane and cinnamamide alkaloids from Scopolia tangutica by high-performance liquid chromatography with quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry. J Sep Sci. 42 (6), 1163-1173 (2019).
- Agnes, S. A., et al. Implementation of a MS/MS database for isoquinoline alkaloids and other annonaceous metabolites. Sci Data. 9 (1), 270 (2022).
- Sixto, A., Pérez-Parada, A., Niell, S., Heinzen, H. GC-MS and LC-MS/MS workflows for the identification and quantitation of pyrrolizidine alkaloids in plant extracts, a case study: Echium plantagineum. Rev Bras Farmacog. 29 (4), 500-503 (2019).
- Wang, H., Xu, X., Wang, X., Guo, W., Jia, W., Zhang, F. An analytical strategy for discovering structural analogues of alkaloids in plant food using characteristic structural fragments extraction by high resolution orbitrap mass spectrometry. LWT- Sci Technol. 154, 112329 (2022).
- Parks, H. M., et al. Redirecting tropane alkaloid metabolism reveals pyrrolidine alkaloid diversity in Atropa belladonna. New Phytol. 237 (5), 1810-1825 (2023).
- . MassBank of North America Available from: https://mona.fiehnlab.ucdavis.edu (2024)
- Maier, I., et al. Fluorodaturatin und Homofluorodaturatin – zwei neue β-carbolinderivate in Samen von Datura stramonium L. var. stramonium. Monatsh Chem. 112, 1425-1439 (1981).
- Jennett-Siems, K., et al. Chemotaxonomy of the pantropical genus Merremia (Convolvulaceae) based on the distribution of tropane alkaloids. Phytochemistry. 66, 1448-1464 (2005).
- Kohnen, K. L., Sezgin, S., Spiteller, M., Hagels, H., Kayser, O. Localization and organization of scopolamine biosynthesis in Duboisia myoporoides R. Br. Plant Cell Physiol. 59 (1), 107-118 (2018).
- Guan, P., et al. Full collision energy ramp-MS2 spectrum in structural analysis relying on MS/MS. Anal Chem. 93 (46), 15381-15389 (2021).
- Al Balkhi, M. H., Schlitz, S., Lesur, D., Lanoue, A., Wadouachi, M., Boitel-Conti, M. Norlittorine and norhyoscyamine identified as products of littorine and hyoscyamine metabolism by 13C-labeling in Datura innoxia hairy roots. Phytochemistry. 74, 105-114 (2012).
- Sumner, L. W., et al. Proposed minimum reporting standards for chemical analysis. Metabolomics. 3, 211-221 (2007).
- Gambaro, V., Labbe, C., Castillo, M. Angeloyl, Tigloyl and Senecioyloxytropane Alkaloids from Schizanthus hookerii. Phytochemistry. 22 (8), 1838-1839 (1983).
- Christen, P., Cretton, S., Humam, M., Bieri, S., Muñoz, O., Joseph-Nathan, P. Chemistry and biological activity of alkaloids from the genus Schizanthus. Phytochem Rev. 19, 615-641 (2020).
- Lounasmaa, M., Tamminen, T. The Tropane Alkaloids. The Alkaloids: Chemistry and Pharmacology. , (1993).
.