Applicazioni della cromatografia liquida Spettrometria di massa tandem nella ricerca sui prodotti naturali: alcaloidi tropanici come caso di studio
Summary
Presentiamo un metodo per l’annotazione e la classificazione rapida basata sulla spettrometria di massa (MS) e sulla spettrometria di massa (MS) degli alcaloidi tropanici, utile sia per la dereplicazione preliminare di campioni contenenti tropani che per la scoperta di nuovi alcaloidi per l’isolamento.
Abstract
Sebbene molti farmaci utilizzati oggi siano di origine sintetica, i prodotti naturali forniscono ancora una ricca fonte di nuova diversità chimica e bioattività e possono produrre spunti promettenti per malattie resistenti o emergenti. La sfida, tuttavia, è duplice: non solo i ricercatori devono trovare prodotti naturali e chiarire le loro strutture, ma devono anche identificare ciò che vale la pena isolare e analizzare (e ciò che è già noto – un processo noto come dereplicazione). Con l’avvento della moderna strumentazione analitica, il ritmo della scoperta e della dereplicazione dei prodotti naturali è accelerato. La cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS) è diventata una tecnica particolarmente preziosa per identificare e classificare le strutture chimiche. Gli alcaloidi tropanici (TA) sono composti di origine vegetale di grande importanza medicinale e tossicologica. In questo studio, abbiamo sviluppato un flusso di lavoro di screening basato su LC-MS/MS utilizzando le molteplici configurazioni MS/MS disponibili su uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo (QQQ) per annotare e classificare le strutture TA in base ai loro distinti modelli di frammentazione. Utilizzando una combinazione di scansioni ioniche del prodotto dipendenti dai dati (DD), scansioni ioniche precursori (PrIS) e scansioni con perdita neutra (NLS), abbiamo applicato questo metodo agli estratti ricchi di TA della belladonna Datura stramonium e Datura metel. Questo metodo è rapido, sensibile ed è stato impiegato con successo sia per la dereplicazione preliminare di campioni complessi contenenti TA sia per la scoperta di un nuovo candidato per l’isolamento, la purificazione (e l’eventuale biodosaggio).
Introduction
Sebbene le molecole completamente sintetiche siano diventate più importanti nella scoperta di farmaci negli ultimi decenni, quasi due terzi di tutti i farmaci approvati negli ultimi 39 anni sono prodotti naturali o ispirati a prodotti naturali,1,2 sottolineando la continua importanza della ricerca sui prodotti naturali. Gli alcaloidi, alcuni prodotti naturali contenenti azoto, sono particolarmente apprezzati per le loro proprietà medicinali. Alcaloidi tropanici (TA) contenenti il [3.2.1.]-sistema biciclico contenente azoto, sono prodotti principalmente da piante delle famiglie delle Solanaceae (belladonna), Erythroxylaceae e Convolvulaceae. Gli esempi includono atropina, scopolamina e cocaina; Più tropani semisintetici o sintetici sono utilizzati anche clinicamente3. Gli AT e i loro derivati sono usati per trattare molte condizioni 3,4 e molti di questi farmaci compaiono nell’elenco dei medicinali essenziali 2023 dell’OMS5. A causa delle loro potenti attività, gli TA sono anche usati a scopo ricreativo (come stimolanti o deliranti) e possono causare avvelenamento in caso di ingestione di piante (o preparati) che li contengono 6,7. Gli TA sono indesiderabili nell’alimentazione umana e animale8 e possono contaminare tè, spezie, cereali, miele e integratori a base di erbe 9,10. A causa sia della loro promessa medicinale che della capacità di avvelenare, sono utili metodi analitici che possono aiutare nella scoperta di nuovi TA (e nell’identificazione di TA noti).
Nella spettrometria di massa tandem (MS/MS), i “filtri di massa” (ad esempio, quadrupoli, tubi a tempo di volo) sono accoppiati insieme fisicamente (“nello spazio”), oppure uno strumento impiega ulteriori fasi di reazione/separazione “in tempo”. La MS/MS nello spazio utilizza diverse modalità per selezionare e frammentare diversi ioni ai diversi filtri di massa (ad esempio, i quadrupoli di uno strumento a triplo quadrupolo o QQQ). Queste diverse modalità possono essere utilizzate per determinare quali frammenti specifici sono prodotti da un dato ione (scansione ionica del prodotto), quali ioni in un campione producono determinati frammenti (scansione ionica precursore o PrIS) o subiscono perdite di una massa caratteristica (scansione a perdita neutra o NLS) o quali composti specifici possiedono quali frammenti specifici (monitoraggio a reazione multipla). MS/MS, quindi, fornisce frammenti utili per proporre strutture per nuovi composti o confermare la presenza di un composto esistente. La MS/MS è sempre più utilizzata nei campi della scoperta di farmaci, della chimica dei prodotti naturali e della metabolomica11,12 ed è stata utilizzata per profilare specie contenenti alcaloidi (per la caratterizzazione fitochimica o l’analisi chemiotassonomica) e per rilevare e quantificare alcaloidi specifici in alimenti o piante medicinali 10,13,14,15,16.
Nonostante le numerose tecniche di spettrometria di massa disponibili, ci sono sfide nella ricerca di nuovi alcaloidi. Oltre a trovare un organismo candidato da selezionare, una conferma strutturale completa di un alcaloide è un processo arduo che può includere molte tecniche analitiche diverse. Inoltre, i ricercatori potrebbero isolare un composto già noto, sprecando lavoro, tempo e risorse. Ciò è particolarmente difficile per gli AT, dove vengono segnalati centinaia, se non migliaia, di TA, molti dei quali sono isomerici tra loro. Il processo di “identificare i noti e distinguerli dagli sconosciuti” è noto come dereplicazione. I database dei tempi di ritenzione (r.t.s) e i frammenti di massa di diversi TA e altri composti sono pubblicati per aiutare in questo processo 17,18. Ciononostante, la dereplicazione è laboriosa; La semplice annotazione (cioè l’assegnazione di strutture putative a) gli alcaloidi nell’intero cromatogramma LC-MS/MS di un campione richiede molto tempo. Recentemente, sia la rete molecolare1 9,20 che la dereplicazione manuale 18,21,22 sono state utilizzate per la benzilisochinolina, l’indolo monoterpenico e gli alcaloidi tropanici, e i Pris sono stati utilizzati per il “filtraggio strutturale” degli spettri per identificare alcaloidi di tipo pirrolizidina e solanina23,24. Tuttavia, non sono disponibili metodi o flussi di lavoro specifici per la dereplicazione rapida basata su LC-MS/MS di campioni contenenti TA, anche se gli AT possiedono frammenti comuni e facilmente identificabili (Figura 1). Il metodo qui descritto utilizza una combinazione di scansioni ioniche del prodotto dipendenti dai dati (DD), PrIS e NLS per annotare e classificare le strutture TA nelle piante in base sia ai distinti modelli di frammentazione per tropani mono-, di- e trisostituiti (Figura 1A) sia alle perdite di gruppi estere comuni presenti in questi alcaloidi (Figura 1B). Gli organismi oggetto dello studio sono diverse specie del genere Datura. Una ricca fonte di diversi TA, la Datura è stata utilizzata nel corso della storia del mondo per scopi medicinali e culturali17– ed è una matrice difficile da dereplicare a causa dei suoi numerosi TA strutturalmente simili, fornendoci campioni interessanti su cui testare il nostro metodo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sebbene i parametri dello strumento forniti nel protocollo consentano prestazioni soddisfacenti, l’uso efficace di questo metodo può richiedere un’attenta attenzione o l’ottimizzazione di diversi passaggi critici. Sebbene il gradiente di solvente HPLC fornito nella fase 2.2 sia generalmente appropriato per gli alcaloidi tropanici, potrebbe essere necessario modificarlo a seconda del profilo alcaloide tropanico del campione o della specie vegetale esaminata. Il volume di iniezione del ca…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato da una borsa di ricerca della facoltà (Northern Michigan University, assegnata a M.A.C.), da una borsa di ricerca universitaria (Northern Michigan University, assegnata a J.C) e dal Dipartimento di Chimica. Gli autori desiderano ringraziare John Berger (NMU) per l’assistenza nella preparazione dei tessuti vegetali, Hannah Hawkins (NMU) per la manutenzione della LC-MS e l’assistenza nella risoluzione dei problemi, e il Dr. Ryan Fornwald e i suoi studenti CH 495 (Natural Products Synthesis) per la loro preparazione della miscela di acetiltropina. Gli autori desiderano anche ringraziare il Dr. Daniel Jones (Michigan State University) per l’acquisizione di spettri MS/MS ad alta risoluzione.
Materials
| Acetonitrile, For UHPLC, suitable for mass spectometry | Sigma-Aldrich | 900667 | HPLC solvent |
| Argon gas | AirGas | AR UHP300 | CID gas |
| Formic acid, 99% for analysis | Thermo Scientific | AC270480010 | HPLC additive |
| Guard column holder | Restek | 25812 | |
| HPLC, Shimadzu LC-2030C 3D Plus | Shimadzu | 228-65802-58 | HPLC column |
| LCMS, Shimdazu LCMS-8045 | Shimadzu | 225-31800-44 | Mass spectrometer; we ran LabSolutions software, which is standard for Shimadzu instruments |
| Liquid nitrogen | AirGas | NI 180LT22 | |
| Methanol, for HPLC/UHPLC/LCMS | VWR | BDH 85800.400 | For making extraction solvent |
| Microcentrifuge | VWR | 2400-37 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Mortar | Fisher Scientific | FB961C | For grinding plant tissues |
| Pestle | Fisher Scientific | FB961M | For grinding plant tissues |
| Pipette 1000 mL | Gilson | F144059M | |
| Pipette tip 1000 mL | Fisher scientific | 02-707-404 | |
| Plant tissues | Various sources | N/A | Can be anything wild or cultivated |
| Polypropylene conical tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-539-4 | |
| Polystyrene cooler | ULINE | S-18312 | The type of coolers that reagents for molecular biology are shipped in would be appropriate |
| Roc C18 3 µm, 100 mm x 4.6 mm | Restek | 9534315 | HPLC column |
| Roc C18, 10 mm x 4 mm | Restek | 953450210 | Guard column |
| Rocking shaker | Themo Scientific | 11-676-680 | |
| Screw thread vial convenience kit (9 mm) | Fisher scientific | 13-622-190 | LCMS autosampler vials |
| Syringe, 3 mL | Fisher Scientific | 03-377-27 | |
| Syringe filter 0.45 µm | Avantor/VWR | 76479-008 | |
| Water, for use in liquid chromatography and mass spectrometry | JT Baker | 9831-03 | For making extraction solvent |
| Water solution, contains 0.1% v/v formic acid, For UHPLC, suitable for mass spectometry | Sigma-Aldrich | 900687-1L | HPLC solvent |
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