天然物研究における液体クロマトグラフィータンデム質量分析の応用:ケーススタディとしてのトロパンアルカロイド
Summary
トロパンアルカロイドの迅速な質量分析(MS)/質量分析(MS)ベースのアノテーションと分類の方法を提示し、トロパン含有サンプルの予備的な再現性の除去と単離のための新規アルカロイドの発見の両方に役立ちます。
Abstract
今日利用されている多くの薬品は合成由来ですが、天然物は依然として新しい化学的多様性と生物活性の豊富な供給源を提供し、耐性のある病気や新興の病気の有望な手がかりを生み出すことができます。しかし、研究者は天然物を見つけてその構造を解明するだけでなく、分離して分析する価値のあるもの(およびすでに知られているもの、つまり複製除去として知られるプロセス)を特定する必要があります。最新の分析機器の出現により、天然物の発見とデレプリケーションのペースは加速しています。液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC-MS/MS)は、化学構造の同定と分類に特に有用な手法となっています。トロパンアルカロイド(TA)は、薬効上および毒物学的に重要な植物由来の化合物です。この研究では、トリプル四重極(QQQ)質量分析計で利用可能な複数のMS/MS構成を利用して、TA構造の明確なフラグメンテーションパターンに基づいてアノテーションおよび分類するLC-MS/MSベースのスクリーニングワークフローを開発しました。データ依存性(DD)プロダクトイオンスキャン、プリカーサーイオンスキャン(PrIS)、およびニュートラルロススキャン(NLS)を組み合わせて使用することにより、この方法をナイトシェードである チョウセンアサガオストラモニウム およびチョウセンアサガオ メテル のTAリッチ抽出物に適用しました。この方法は迅速で感度が高く、複雑なTA含有サンプルの予備的な再現性の除去と、単離、精製(および最終的にはバイオアッセイ)の新規候補の発見の両方に採用されました。
Introduction
ここ数十年で創薬において完全合成分子が目立つようになりましたが、過去39年間に承認された医薬品の3分の2近くが天然物または天然物に触発されたものであり1,2 、天然物研究の継続的な重要性を強調しています。アルカロイドは、特定の窒素含有天然物であり、その薬効成分で特に高く評価されています。[3.2.1.]-二環式窒素含有システムは、主にナス科(ナイトシェード)、エリスロキシラ科、およびコンボルブラ科の植物によって生産されます。例としては、アトロピン、スコポラミン、コカインなどがあります。複数の半合成または合成トロパンも臨床的に使用されています3。TAとその誘導体は、多くの疾患の治療に使用されており3,4、これらの薬剤のいくつかは、WHOの2023年必須医薬品リスト5に掲載されています。TAはその強力な活性のために、娯楽としても(覚醒剤またはせん妄剤として)使用され、それらを含む植物(または調剤)を摂取すると中毒を引き起こす可能性があります6,7。TAは、人間および動物の食品8には好ましくなく、お茶、香辛料、穀物、蜂蜜、およびハーブサプリメント9,10を汚染する可能性があります。その薬効と毒殺能力の両方から、新しいTAの発見(および既知のTAの同定)に役立つ分析法が有用です。
タンデム質量分析(MS/MS)では、「質量フィルター」(四重極、飛行時間型チューブなど)を物理的に結合するか(「空間内」)、または装置が追加の「インタイム」反応/分離ステップを使用します。インスペースMS/MSは、さまざまなモードを使用して、異なる質量フィルター(トリプル四重極やQQQ装置の四重極など)でさまざまなイオンを選択し、フラグメンテーションします。これらの異なるモードを使用して、特定のイオンによってどの特定のフラグメントが作られるか(プロダクトイオンスキャン)、サンプル中のどのイオンが特定のフラグメントを生成するか(プリカーサーイオンスキャンまたはPrIS)、または特性質量の損失を受けるか(ニュートラルロススキャンまたはNLS)、またはどの特定の化合物がどの特定のフラグメントを持っているか(マルチプルリアクションモニタリング)を決定できます。したがって、MS/MSは、新しい化合物の構造を提案したり、既存の化合物の存在を確認したりするのに役立つフラグメントを提供します。MS/MSは、創薬、天然物化学、およびメタボロミクスの分野でますます使用されており11,12、アルカロイド含有種のプロファイリング(植物化学的特性評価または化学分類学的分析用)や、食品または薬用植物の特定のアルカロイドの検出および定量10,13,14,15,16に使用されています。
多くの質量分析技術が利用可能であるにもかかわらず、新しいアルカロイドの探索には課題があります。スクリーニングする候補生物を見つけることに加えて、アルカロイドの完全な構造確認は、多くの異なる分析技術を含む困難なプロセスです。さらに、研究者はすでに知られている化合物を分離し、労力、時間、リソースを浪費する可能性があります。これは、数千とは言わないまでも数百のTAが報告されており、その多くが互いに異性体であるTAにとっては特に困難です。「既知のものを特定し、未知のものと区別する」プロセスは、レプリケーション解除として知られています。このプロセスを支援するために、さまざまなTAや他の化合物の保持時間(r.t.s)と質量断片のデータベースが公開されています17,18。それにもかかわらず、レプリケーション解除は面倒です。サンプル全体のLC-MS/MSクロマトグラム中のアルカロイドにアノテーションを付ける(つまり、推定構造を割り当てる)だけでは時間がかかります。最近、分子ネットワーク1 9,20および手動脱複製18,21,22の両方がベンジルイソキノリン、モノテルペンインドール、およびトロパンアルカロイドに使用され、PrISはピロリジジンおよびソラニン型アルカロイド23,24を同定するためのスペクトルの「構造フィルタリング」に使用されている.しかし、TAは共通の、容易に識別できるフラグメントを持っているにもかかわらず、TA含有サンプルの迅速なLC-MS/MSベースの重複除去に利用できる特定の方法やワークフローはありません(図1)。ここで説明する方法では、データ依存性(DD)プロダクトイオンスキャン、PrIS、NLSを組み合わせて、モノ置換、ジ置換、および三置換トロパンの明確なフラグメンテーションパターン(図1A)と、これらのアルカロイドに見られる一般的なエステル基の損失(図1B)の両方に基づいて、植物のTA構造をアノテーションおよび分類します。研究生物は、ナイトシェード属のチョウセンアサガオのいくつかの種です。多様なTAの豊富な供給源であるチョウセンアサガオは、世界の歴史を通じて医療および文化的な目的で使用されており17、構造的に類似したTAが多数あるため、複製解除が困難なマトリックスであり、私たちの方法をテストするための魅力的なサンプルを提供してくれます。
Protocol
Representative Results
Discussion
プロトコールで提供される機器パラメータは満足のいく性能を可能にしますが、このメソッドをうまく使用するには、いくつかの重要なステップに細心の注意を払ったり、最適化したりする必要があります。ステップ 2.2 で示した HPLC 溶媒グラジエントは、一般的にトロパンアルカロイドに適していますが、検査対象のサンプルまたは植物種のトロパンアルカロイド?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、Faculty Research Grant(ノーザンミシガン大学、M.A.C.に授与)、学部研究フェローシップ(ノーザンミシガン大学、J.C.に授与)、および化学科によって資金提供されました。著者らは、植物組織調製の支援を提供してくださった John Berger 氏 (NMU)、LC-MS のメンテナンスとトラブルシューティングの支援を提供してくださった Hannah Hawkins 氏 (NMU)、アセチルトロピン混合物の調製についていただいた Dr. Ryan Fornwald 氏と彼の CH 495 (Natural Products Synthesis) の学生に感謝します。また、高分解能 MS/MS スペクトルを取得してくださった Daniel Jones 博士 (ミシガン州立大学) にも感謝いたします。
Materials
| Acetonitrile, For UHPLC, suitable for mass spectometry | Sigma-Aldrich | 900667 | HPLC solvent |
| Argon gas | AirGas | AR UHP300 | CID gas |
| Formic acid, 99% for analysis | Thermo Scientific | AC270480010 | HPLC additive |
| Guard column holder | Restek | 25812 | |
| HPLC, Shimadzu LC-2030C 3D Plus | Shimadzu | 228-65802-58 | HPLC column |
| LCMS, Shimdazu LCMS-8045 | Shimadzu | 225-31800-44 | Mass spectrometer; we ran LabSolutions software, which is standard for Shimadzu instruments |
| Liquid nitrogen | AirGas | NI 180LT22 | |
| Methanol, for HPLC/UHPLC/LCMS | VWR | BDH 85800.400 | For making extraction solvent |
| Microcentrifuge | VWR | 2400-37 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Mortar | Fisher Scientific | FB961C | For grinding plant tissues |
| Pestle | Fisher Scientific | FB961M | For grinding plant tissues |
| Pipette 1000 mL | Gilson | F144059M | |
| Pipette tip 1000 mL | Fisher scientific | 02-707-404 | |
| Plant tissues | Various sources | N/A | Can be anything wild or cultivated |
| Polypropylene conical tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-539-4 | |
| Polystyrene cooler | ULINE | S-18312 | The type of coolers that reagents for molecular biology are shipped in would be appropriate |
| Roc C18 3 µm, 100 mm x 4.6 mm | Restek | 9534315 | HPLC column |
| Roc C18, 10 mm x 4 mm | Restek | 953450210 | Guard column |
| Rocking shaker | Themo Scientific | 11-676-680 | |
| Screw thread vial convenience kit (9 mm) | Fisher scientific | 13-622-190 | LCMS autosampler vials |
| Syringe, 3 mL | Fisher Scientific | 03-377-27 | |
| Syringe filter 0.45 µm | Avantor/VWR | 76479-008 | |
| Water, for use in liquid chromatography and mass spectrometry | JT Baker | 9831-03 | For making extraction solvent |
| Water solution, contains 0.1% v/v formic acid, For UHPLC, suitable for mass spectometry | Sigma-Aldrich | 900687-1L | HPLC solvent |
References
- Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural products as sources of new drugs over the 30 years from 1981 to 2010. J Nat Prod. 75, 311-335 (2012).
- Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural products as sources of new drugs over the nearly four decades from 01/1981 to 09/2019. J Nat Prod. 83 (3), 770-803 (2020).
- Kohnen-Johannsen, K., Kayser, O. Tropane alkaloids: Chemistry, pharmacology, biosynthesis and production. Molecules. 24 (4), 796 (2019).
- Shim, K. H., Kang, M. J., Sharma, N., An, S. S. A. Beauty of the beast: anticholinergic tropane alkaloids in therapeutics. Nat Prod Bioprospect. 12 (1), 33 (2022).
- Web Annex A. World Health Organization Model List of Essential Medicines – 23rd List, 2023. The Selection and Use of Essential Medicines 2023: Executive Summary of the Report of the 24th WHO Expert Committee on the Selection and Use of Essential Medicines. , 24-28 (2023).
- Kerchner, A., Farkas, A. Worldwide poisoning potential of Brugmansia and Datura. Forensic Toxicol. 38, 30-41 (2020).
- Hanna, J. P., Schmidley, J. W., Braselton, W. E. Datura delirium. Clin Neuropharmacol. 15, 109-113 (1992).
- Alexander, J., et al. Scientific opinion of the panel on contaminants in the food chain on a request from the European Commission on tropane alkaloids (from Datura sp.) as undesirable substances in animal feed. EFSA J. 691, 1-55 (2008).
- González-Gómez, L., Morante-Zarcero, S., Pérez-Quintanilla, D., Sierra, I. Occurrence and chemistry of Tropane alkaloids in foods, with a focus on sample analysis methods: A review on recent trends and technological advances. Foods. 11 (3), 407 (2022).
- Cirlini, M., Cappucci, V., Galaverna, G., Dall’Asta, C., Bruni, R. A sensitive UHPLC-ESI-MS/MS method for the determination of tropane alkaloids in herbal teas and extracts. Food Control. 105, 285-291 (2019).
- Amorim Madiera, P. J., Florencio, M. H., Prasain, J. Applications of Tandem Mass Spectrometry: From Structural Analysis to Fundamental Studies. Tandem Mass Spectrometry – Applications and Principles. , (2012).
- Xing, J., Xie, C., Lou, H. Recent applications of liquid chromatography-mass spectrometry in natural products bioanalysis. J Pharm Biomed Anal. 44 (2), 368-378 (2007).
- Negrin, A., Long, C., Motley, T. J., Kennelly, E. J. LC-MS metabolomics and chemotaxonomy of caffeine-containing holly (Ilex) species and related taxa in the Aquifoliaceae. J. Agric. Food Chem. 67 (19), 5687-5699 (2019).
- Och, A., Szewczyk, K., Pecio, L., Stochmal, A., Zaluski, D., Bogucka-Kocka, A. UPLC-MS/MS profile of alkaloids with cytotoxic properties of selected medicinal plants of the Berberidaceae and Papaveraceae families. Oxid Med Cell Longevity. 2017, 9369872 (2017).
- Li, Y., Pang, T., Shi, J., Liu, X., Deng, J., Lin, Q. Simultaneous determination of alkaloids and their related tobacco-specific nitrosamines in tobacco leaves using LC-MS-MS. J Chromatogr Sci. 53 (10), 1730-1736 (2015).
- González-Gómez, L., Morante-Zarcero, S., Pereira, J. A. M., Câmara, J. S., Sierra, I. Improved analytical approach for determination of tropane alkaloids in leafy vegetables based on µ-QuEChERS combined with HPLC-MS/MS. Toxins. 14 (10), 650 (2022).
- Cinelli, M. A., Jones, A. D. Alkaloids of the Genus Datura: Review of a rich resource for natural product discovery. Molecules. 26, 2629 (2021).
- Gonçalves Dantas, C., et al. Dereplication of tropane alkaloids from four Erythroxylum species using liquid chromatography coupled with ESI-MSn and HRESIMS. Rapid Commun Mass Spectrom. 37 (21), e9629 (2023).
- Santos, C. L. G., et al. Molecular networking-based dereplication of strictosidine-derived monoterpene indole alkaloids from the curare ingredient Strychnos peckii. Rapid Commun Mass Spectrom. 34 (3), e8683 (2020).
- Qin, G. F., et al. MS/MS-based molecular networking: An efficient approach for natural products dereplication. Molecules. 28, 157 (2023).
- Du, N., Zhou, W., Jin, H., Liu, Y., Zhou, H., Liang, X. Characterization of tropane and cinnamamide alkaloids from Scopolia tangutica by high-performance liquid chromatography with quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry. J Sep Sci. 42 (6), 1163-1173 (2019).
- Agnes, S. A., et al. Implementation of a MS/MS database for isoquinoline alkaloids and other annonaceous metabolites. Sci Data. 9 (1), 270 (2022).
- Sixto, A., Pérez-Parada, A., Niell, S., Heinzen, H. GC-MS and LC-MS/MS workflows for the identification and quantitation of pyrrolizidine alkaloids in plant extracts, a case study: Echium plantagineum. Rev Bras Farmacog. 29 (4), 500-503 (2019).
- Wang, H., Xu, X., Wang, X., Guo, W., Jia, W., Zhang, F. An analytical strategy for discovering structural analogues of alkaloids in plant food using characteristic structural fragments extraction by high resolution orbitrap mass spectrometry. LWT- Sci Technol. 154, 112329 (2022).
- Parks, H. M., et al. Redirecting tropane alkaloid metabolism reveals pyrrolidine alkaloid diversity in Atropa belladonna. New Phytol. 237 (5), 1810-1825 (2023).
- . MassBank of North America Available from: https://mona.fiehnlab.ucdavis.edu (2024)
- Maier, I., et al. Fluorodaturatin und Homofluorodaturatin – zwei neue β-carbolinderivate in Samen von Datura stramonium L. var. stramonium. Monatsh Chem. 112, 1425-1439 (1981).
- Jennett-Siems, K., et al. Chemotaxonomy of the pantropical genus Merremia (Convolvulaceae) based on the distribution of tropane alkaloids. Phytochemistry. 66, 1448-1464 (2005).
- Kohnen, K. L., Sezgin, S., Spiteller, M., Hagels, H., Kayser, O. Localization and organization of scopolamine biosynthesis in Duboisia myoporoides R. Br. Plant Cell Physiol. 59 (1), 107-118 (2018).
- Guan, P., et al. Full collision energy ramp-MS2 spectrum in structural analysis relying on MS/MS. Anal Chem. 93 (46), 15381-15389 (2021).
- Al Balkhi, M. H., Schlitz, S., Lesur, D., Lanoue, A., Wadouachi, M., Boitel-Conti, M. Norlittorine and norhyoscyamine identified as products of littorine and hyoscyamine metabolism by 13C-labeling in Datura innoxia hairy roots. Phytochemistry. 74, 105-114 (2012).
- Sumner, L. W., et al. Proposed minimum reporting standards for chemical analysis. Metabolomics. 3, 211-221 (2007).
- Gambaro, V., Labbe, C., Castillo, M. Angeloyl, Tigloyl and Senecioyloxytropane Alkaloids from Schizanthus hookerii. Phytochemistry. 22 (8), 1838-1839 (1983).
- Christen, P., Cretton, S., Humam, M., Bieri, S., Muñoz, O., Joseph-Nathan, P. Chemistry and biological activity of alkaloids from the genus Schizanthus. Phytochem Rev. 19, 615-641 (2020).
- Lounasmaa, M., Tamminen, T. The Tropane Alkaloids. The Alkaloids: Chemistry and Pharmacology. , (1993).
.