تطبيقات قياس الطيف الكتلي الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة في أبحاث المنتجات الطبيعية: قلويدات التروبان كدراسة حالة
Summary
نقدم طريقة للتعليق التوضيحي القائم على قياس الطيف الكتلي السريع (MS) / قياس الطيف الكتلي (MS) وتصنيف قلويدات التروبان ، وهي مفيدة لكل من التكرار الأولي للعينات المحتوية على التروبان واكتشاف قلويدات جديدة للعزل.
Abstract
على الرغم من أن العديد من الأدوية المستخدمة اليوم اصطناعية في الأصل ، إلا أن المنتجات الطبيعية لا تزال توفر مصدرا غنيا للتنوع الكيميائي الجديد والنشاط البيولوجي ، ويمكن أن تسفر عن خيوط واعدة للأمراض المقاومة أو الناشئة. ومع ذلك، فإن التحدي ذو شقين: لا يجب على الباحثين العثور على المنتجات الطبيعية وتوضيح هياكلها فحسب، بل يجب عليهم أيضا تحديد ما يستحق العزل والفحص (وما هو معروف بالفعل – وهي عملية تعرف باسم إزالة التكرار). مع ظهور الأجهزة التحليلية الحديثة ، تسارعت وتيرة اكتشاف المنتجات الطبيعية وإلغاء تكرارها. أصبح قياس الطيف الكتلي الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة (LC-MS / MS) تقنية ذات قيمة خاصة لتحديد وتصنيف الهياكل الكيميائية. قلويدات التروبان (TAs) هي مركبات مشتقة من النباتات ذات أهمية طبية وسمية كبيرة. في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير سير عمل فحص قائم على LC-MS / MS باستخدام تكوينات MS / MS المتعددة المتاحة على مطياف الكتلة الثلاثي الرباعي (QQQ) للتعليق على هياكل TA وتصنيفها بناء على أنماط التجزئة المميزة الخاصة بها. باستخدام مجموعة من عمليات المسح الأيوني للمنتج المعتمدة على البيانات (DD) ، ومسح أيون السلائف (PrIS) ، ومسح الخسارة المحايدة (NLS) ، قمنا بتطبيق هذه الطريقة على مقتطفات غنية ب TA من الباذنجان Datura stramonium و Datura metel. هذه الطريقة سريعة وحساسة ، وقد تم استخدامها بنجاح لكل من التكرار الأولي للعينات المعقدة المحتوية على TA ولاكتشاف مرشح جديد للعزل والتنقية (والمقايسة الحيوية في نهاية المطاف).
Introduction
على الرغم من أن الجزيئات الاصطناعية بالكامل أصبحت أكثر بروزا في اكتشاف الأدوية في العقود الأخيرة، إلا أن ما يقرب من ثلثي جميع الأدوية المعتمدة من السنوات ال 39 الماضية هي منتجات طبيعية أو مستوحاة من المنتجات الطبيعية،1،2 مما يؤكد الأهمية المستمرة لأبحاث المنتجات الطبيعية. قلويدات ، بعض المنتجات الطبيعية المحتوية على النيتروجين ، تحظى بتقدير خاص لخصائصها الطبية. قلويدات التروبان (TAs) التي تحتوي على [3.2.1.]- نظام يحتوي على النيتروجين ثنائي الحلقات ، يتم إنتاجه في الغالب بواسطة النباتات في عائلات الباذنجانيات (الباذنجان) ، و Erythroxylaceae ، و Convolvulaceae. ومن الأمثلة على ذلك الأتروبين والسكوبولامين والكوكايين. كما تستخدم العديد من التروبان شبه الاصطناعية أو الاصطناعية سريريا3. تستخدم TAs ومشتقاتها لعلاج العديد من الحالات 3,4 ويظهر العديد من هذه الأدوية في قائمة منظمة الصحة العالمية لعام 2023 للأدوية الأساسية5. بسبب أنشطتها القوية ، تستخدم TAs أيضا بشكل ترفيهي (كمنشطات أو هذيان) ويمكن أن تسبب التسمم عند تناول النباتات (أو المستحضرات) التي تحتوي عليها 6,7. TAs غير مرغوب فيها في الأغذية البشرية والحيوانية8 ويمكن أن تلوث الشاي والتوابل والحبوب والعسل والمكملات العشبية 9,10. نظرا لوعدها الطبي وقدرتها على السم ، فإن الطرق التحليلية التي يمكن أن تساعد في اكتشاف TAs جديدة (وتحديد TAs المعروفة) مفيدة.
في قياس الطيف الكتلي الترادفي (MS / MS) ، يتم إقران “مرشحات الكتلة” (على سبيل المثال ، رباعيات الأقطاب ، وأنابيب وقت الطيران) معا فيزيائيا (“في الفضاء”) ، أو يستخدم الجهاز خطوات تفاعل / فصل إضافية “في الوقت المناسب”. يستخدم MS / MS في الفضاء طرقا مختلفة لتحديد وتجزئة أيونات مختلفة عند مرشحات الكتلة المختلفة (على سبيل المثال ، رباعيات الأقطاب لجهاز ثلاثي الأقطاب أو QQQ). يمكن استخدام هذه الأنماط المختلفة لتحديد الأجزاء المحددة التي يتم تصنيعها بواسطة أيون معين (مسح أيون المنتج) ، أو الأيونات الموجودة في العينة التي تنتج شظايا معينة (مسح أيون السلائف أو PrIS) أو تتعرض لخسائر كتلة مميزة (مسح الخسارة المحايدة أو NLS) ، أو المركبات المحددة التي تمتلك شظايا محددة (مراقبة التفاعل المتعدد). لذلك ، يوفر MS / MS شظايا مفيدة لاقتراح هياكل لمركبات جديدة أو تأكيد وجود مركب موجود. يستخدم MS / MS بشكل متزايد في اكتشاف الأدوية ، وكيمياء المنتجات الطبيعية ، ومجالات الأيض11،12 ، وقد تم استخدامه لتحديد الأنواع المحتوية على قلويدات (للتوصيف الكيميائي النباتي أو التحليل الكيميائي التصنيفي) وللكشف عن قلويدات معينة وتحديدها في الأغذية أو النباتات الطبية10،13،14،15،16.
على الرغم من العديد من تقنيات قياس الطيف الكتلي المتاحة ، هناك تحديات في العثور على قلويدات جديدة. بالإضافة إلى العثور على كائن حي مرشح لفحصه ، فإن التأكيد الهيكلي الكامل للقلويد هو عملية شاقة قد تتضمن العديد من التقنيات التحليلية المختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للباحثين عزل مركب معروف بالفعل ، مما يهدر العمل والوقت والموارد. هذا صعب بشكل خاص على TAs ، حيث يتم الإبلاغ عن المئات ، إن لم يكن الآلاف من TAs ، وكثير منها متساوي مع بعضها البعض. تعرف عملية “تحديد المعروفين وتمييزهم عن المجهولين” باسم dereplication. يتم نشر قواعد بيانات أوقات الاحتفاظ (r.t.s) وشظايا الكتلة من TAs المختلفة والمركبات الأخرى للمساعدة في هذه العملية17,18. ومع ذلك ، فإن إلغاء النسخ أمر شاق. مجرد التعليق التوضيحي (أي تعيين الهياكل المفترضة) على القلويدات في مخطط كروماتوجرام LC-MS / MS بالكامل للعينة يستغرق وقتا طويلا. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام كل من الشبكات الجزيئية19،20 و dereplicationاليدوي 18،21،22 لبنزيل إيزوكينولين ، إندول مونوتربين ، وقلويدات التروبان ، وتم استخدام PrISs “للترشيح الهيكلي” للأطياف لتحديد قلويدات بيروليزيدين والسولانين23,24. لا توجد طرق أو مهام سير عمل محددة متاحة للتكرار السريع القائم على LC-MS / MS للعينات المحتوية على TA ، على الرغم من أن TAs تمتلك شظايا شائعة يسهل التعرف عليها (الشكل 1). تستخدم الطريقة الموصوفة هنا مجموعة من عمليات المسح الأيوني للمنتجات المعتمدة على البيانات (DD) ، و PrISs ، و NLSs لشرح وتصنيف هياكل TA في النباتات بناء على كل من أنماط التجزئة المميزة للتروبان أحادي وثنائي وثلاثي الاستبدال (الشكل 1 أ) وفقدان مجموعات الإستر الشائعة الموجودة في هذه القلويدات (الشكل 1 ب). الكائنات الحية للدراسة هي عدة أنواع في جنس الباذنجان الداتورة. مصدر غني للتنوع TAs ، تم استخدام الداتورة عبر تاريخ العالم للأغراض الطبية والثقافية17– وهي مصفوفة صعبة لإلغاء تكرارها بسبب العديد من TAs المتشابهة هيكليا ، مما يوفر لنا عينات جذابة لاختبار طريقتنا.
Protocol
Representative Results
Discussion
وعلى الرغم من أن بارامترات الأجهزة المنصوص عليها في البروتوكول تسمح بأداء مرض، فإن الاستخدام الناجح لهذه الطريقة قد يتطلب اهتماما دقيقا بعدة خطوات حاسمة أو تحسينها إلى المستوى الأمثل. في حين أن تدرج مذيب HPLC المقدم في الخطوة 2.2 مناسب بشكل عام لقلويدات التروبان ، فقد يحتا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من خلال منحة أبحاث أعضاء هيئة التدريس (جامعة ميشيغان الشمالية ، الممنوحة ل MAC) ، وزمالة بحثية جامعية (جامعة شمال ميشيغان ، منحت ل JC) ، وقسم الكيمياء. يود المؤلفون أن يشكروا جون بيرغر (NMU) على المساعدة في تحضير الأنسجة النباتية ، وهانا هوكينز (NMU) على صيانة LC-MS والمساعدة في استكشاف الأخطاء وإصلاحها ، والدكتور ريان فورنوالد وطلابه CH 495 (تخليق المنتجات الطبيعية) على إعدادهم لمزيج الأسيتيل تروبين. ويود المؤلفون أيضا أن يشكروا الدكتور دانيال جونز (جامعة ولاية ميشيغان) على حصوله على أطياف MS/MS عالية الاستبانة.
Materials
| Acetonitrile, For UHPLC, suitable for mass spectometry | Sigma-Aldrich | 900667 | HPLC solvent |
| Argon gas | AirGas | AR UHP300 | CID gas |
| Formic acid, 99% for analysis | Thermo Scientific | AC270480010 | HPLC additive |
| Guard column holder | Restek | 25812 | |
| HPLC, Shimadzu LC-2030C 3D Plus | Shimadzu | 228-65802-58 | HPLC column |
| LCMS, Shimdazu LCMS-8045 | Shimadzu | 225-31800-44 | Mass spectrometer; we ran LabSolutions software, which is standard for Shimadzu instruments |
| Liquid nitrogen | AirGas | NI 180LT22 | |
| Methanol, for HPLC/UHPLC/LCMS | VWR | BDH 85800.400 | For making extraction solvent |
| Microcentrifuge | VWR | 2400-37 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Mortar | Fisher Scientific | FB961C | For grinding plant tissues |
| Pestle | Fisher Scientific | FB961M | For grinding plant tissues |
| Pipette 1000 mL | Gilson | F144059M | |
| Pipette tip 1000 mL | Fisher scientific | 02-707-404 | |
| Plant tissues | Various sources | N/A | Can be anything wild or cultivated |
| Polypropylene conical tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 05-539-4 | |
| Polystyrene cooler | ULINE | S-18312 | The type of coolers that reagents for molecular biology are shipped in would be appropriate |
| Roc C18 3 µm, 100 mm x 4.6 mm | Restek | 9534315 | HPLC column |
| Roc C18, 10 mm x 4 mm | Restek | 953450210 | Guard column |
| Rocking shaker | Themo Scientific | 11-676-680 | |
| Screw thread vial convenience kit (9 mm) | Fisher scientific | 13-622-190 | LCMS autosampler vials |
| Syringe, 3 mL | Fisher Scientific | 03-377-27 | |
| Syringe filter 0.45 µm | Avantor/VWR | 76479-008 | |
| Water, for use in liquid chromatography and mass spectrometry | JT Baker | 9831-03 | For making extraction solvent |
| Water solution, contains 0.1% v/v formic acid, For UHPLC, suitable for mass spectometry | Sigma-Aldrich | 900687-1L | HPLC solvent |
References
- Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural products as sources of new drugs over the 30 years from 1981 to 2010. J Nat Prod. 75, 311-335 (2012).
- Newman, D. J., Cragg, G. M. Natural products as sources of new drugs over the nearly four decades from 01/1981 to 09/2019. J Nat Prod. 83 (3), 770-803 (2020).
- Kohnen-Johannsen, K., Kayser, O. Tropane alkaloids: Chemistry, pharmacology, biosynthesis and production. Molecules. 24 (4), 796 (2019).
- Shim, K. H., Kang, M. J., Sharma, N., An, S. S. A. Beauty of the beast: anticholinergic tropane alkaloids in therapeutics. Nat Prod Bioprospect. 12 (1), 33 (2022).
- Web Annex A. World Health Organization Model List of Essential Medicines – 23rd List, 2023. The Selection and Use of Essential Medicines 2023: Executive Summary of the Report of the 24th WHO Expert Committee on the Selection and Use of Essential Medicines. , 24-28 (2023).
- Kerchner, A., Farkas, A. Worldwide poisoning potential of Brugmansia and Datura. Forensic Toxicol. 38, 30-41 (2020).
- Hanna, J. P., Schmidley, J. W., Braselton, W. E. Datura delirium. Clin Neuropharmacol. 15, 109-113 (1992).
- Alexander, J., et al. Scientific opinion of the panel on contaminants in the food chain on a request from the European Commission on tropane alkaloids (from Datura sp.) as undesirable substances in animal feed. EFSA J. 691, 1-55 (2008).
- González-Gómez, L., Morante-Zarcero, S., Pérez-Quintanilla, D., Sierra, I. Occurrence and chemistry of Tropane alkaloids in foods, with a focus on sample analysis methods: A review on recent trends and technological advances. Foods. 11 (3), 407 (2022).
- Cirlini, M., Cappucci, V., Galaverna, G., Dall’Asta, C., Bruni, R. A sensitive UHPLC-ESI-MS/MS method for the determination of tropane alkaloids in herbal teas and extracts. Food Control. 105, 285-291 (2019).
- Amorim Madiera, P. J., Florencio, M. H., Prasain, J. Applications of Tandem Mass Spectrometry: From Structural Analysis to Fundamental Studies. Tandem Mass Spectrometry – Applications and Principles. , (2012).
- Xing, J., Xie, C., Lou, H. Recent applications of liquid chromatography-mass spectrometry in natural products bioanalysis. J Pharm Biomed Anal. 44 (2), 368-378 (2007).
- Negrin, A., Long, C., Motley, T. J., Kennelly, E. J. LC-MS metabolomics and chemotaxonomy of caffeine-containing holly (Ilex) species and related taxa in the Aquifoliaceae. J. Agric. Food Chem. 67 (19), 5687-5699 (2019).
- Och, A., Szewczyk, K., Pecio, L., Stochmal, A., Zaluski, D., Bogucka-Kocka, A. UPLC-MS/MS profile of alkaloids with cytotoxic properties of selected medicinal plants of the Berberidaceae and Papaveraceae families. Oxid Med Cell Longevity. 2017, 9369872 (2017).
- Li, Y., Pang, T., Shi, J., Liu, X., Deng, J., Lin, Q. Simultaneous determination of alkaloids and their related tobacco-specific nitrosamines in tobacco leaves using LC-MS-MS. J Chromatogr Sci. 53 (10), 1730-1736 (2015).
- González-Gómez, L., Morante-Zarcero, S., Pereira, J. A. M., Câmara, J. S., Sierra, I. Improved analytical approach for determination of tropane alkaloids in leafy vegetables based on µ-QuEChERS combined with HPLC-MS/MS. Toxins. 14 (10), 650 (2022).
- Cinelli, M. A., Jones, A. D. Alkaloids of the Genus Datura: Review of a rich resource for natural product discovery. Molecules. 26, 2629 (2021).
- Gonçalves Dantas, C., et al. Dereplication of tropane alkaloids from four Erythroxylum species using liquid chromatography coupled with ESI-MSn and HRESIMS. Rapid Commun Mass Spectrom. 37 (21), e9629 (2023).
- Santos, C. L. G., et al. Molecular networking-based dereplication of strictosidine-derived monoterpene indole alkaloids from the curare ingredient Strychnos peckii. Rapid Commun Mass Spectrom. 34 (3), e8683 (2020).
- Qin, G. F., et al. MS/MS-based molecular networking: An efficient approach for natural products dereplication. Molecules. 28, 157 (2023).
- Du, N., Zhou, W., Jin, H., Liu, Y., Zhou, H., Liang, X. Characterization of tropane and cinnamamide alkaloids from Scopolia tangutica by high-performance liquid chromatography with quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry. J Sep Sci. 42 (6), 1163-1173 (2019).
- Agnes, S. A., et al. Implementation of a MS/MS database for isoquinoline alkaloids and other annonaceous metabolites. Sci Data. 9 (1), 270 (2022).
- Sixto, A., Pérez-Parada, A., Niell, S., Heinzen, H. GC-MS and LC-MS/MS workflows for the identification and quantitation of pyrrolizidine alkaloids in plant extracts, a case study: Echium plantagineum. Rev Bras Farmacog. 29 (4), 500-503 (2019).
- Wang, H., Xu, X., Wang, X., Guo, W., Jia, W., Zhang, F. An analytical strategy for discovering structural analogues of alkaloids in plant food using characteristic structural fragments extraction by high resolution orbitrap mass spectrometry. LWT- Sci Technol. 154, 112329 (2022).
- Parks, H. M., et al. Redirecting tropane alkaloid metabolism reveals pyrrolidine alkaloid diversity in Atropa belladonna. New Phytol. 237 (5), 1810-1825 (2023).
- . MassBank of North America Available from: https://mona.fiehnlab.ucdavis.edu (2024)
- Maier, I., et al. Fluorodaturatin und Homofluorodaturatin – zwei neue β-carbolinderivate in Samen von Datura stramonium L. var. stramonium. Monatsh Chem. 112, 1425-1439 (1981).
- Jennett-Siems, K., et al. Chemotaxonomy of the pantropical genus Merremia (Convolvulaceae) based on the distribution of tropane alkaloids. Phytochemistry. 66, 1448-1464 (2005).
- Kohnen, K. L., Sezgin, S., Spiteller, M., Hagels, H., Kayser, O. Localization and organization of scopolamine biosynthesis in Duboisia myoporoides R. Br. Plant Cell Physiol. 59 (1), 107-118 (2018).
- Guan, P., et al. Full collision energy ramp-MS2 spectrum in structural analysis relying on MS/MS. Anal Chem. 93 (46), 15381-15389 (2021).
- Al Balkhi, M. H., Schlitz, S., Lesur, D., Lanoue, A., Wadouachi, M., Boitel-Conti, M. Norlittorine and norhyoscyamine identified as products of littorine and hyoscyamine metabolism by 13C-labeling in Datura innoxia hairy roots. Phytochemistry. 74, 105-114 (2012).
- Sumner, L. W., et al. Proposed minimum reporting standards for chemical analysis. Metabolomics. 3, 211-221 (2007).
- Gambaro, V., Labbe, C., Castillo, M. Angeloyl, Tigloyl and Senecioyloxytropane Alkaloids from Schizanthus hookerii. Phytochemistry. 22 (8), 1838-1839 (1983).
- Christen, P., Cretton, S., Humam, M., Bieri, S., Muñoz, O., Joseph-Nathan, P. Chemistry and biological activity of alkaloids from the genus Schizanthus. Phytochem Rev. 19, 615-641 (2020).
- Lounasmaa, M., Tamminen, T. The Tropane Alkaloids. The Alkaloids: Chemistry and Pharmacology. , (1993).
.