Transmisyon elektron mikroskobu için retinal organoid örneklerinin hazırlanması

İnsanlarda ve memelilerde hayati bir görsel duyu organı olan retina, nöron somalarını barındıran üç nükleer katman ve geleneksel sinapslar^ve özel şerit sinaps^2,3 dahil olmak üzere sinaptik bağlantılar 1 tarafından oluşturulan iki pleksiform katman ile karakterize edilen belirgin bir lamine yapı sergiler. Şerit sinaps, vezikül uyarılarının kademeli bir şekilde iletilmesinde çok önemli bir rol oynar ^2,3. Görme süreci, çeşitli nöron ve sinaps seviyeleri boyunca elektro-optik sinyal iletimini içerir ve sonuçta görsel kortekse ^4,5 ulaşır.

Retinal organoidler (RO’lar), retina dokusunun fizyolojik durumlarını in vitro ^1,6,7 taklit eden, indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC’ler) türetilen üç boyutlu (3D) bir kültür sistemini temsil eder. Bu yaklaşım, retina hastalıkları⁸, ilaç taraması⁹ ve retinitis pigmentosa¹⁰ ve glokom¹¹ gibi geri dönüşümsüz retinal dejeneratif durumlar için potansiyel bir tedavi olarak hizmet etmek için umut vaat etmektedir. Güçlü bir in vitro optik iletim sistemi olarak, RO’lar içindeki sinaps, etkili sinyal dönüşümünü ve transferini kolaylaştıran çok önemli bir yapıdır⁵.

RO gelişimi, morfolojik özelliklerine ve moleküler ekspresyon profillerine göre kabaca üç aşamaya ayrılabilir ^6,12. Evre 1’deki RO’lar (D21-D60 civarında), retinanın nöral progenitör hücrelerini, birçok retinal ganglion hücresini (RGC’ler) ve insan fetal gelişiminin ilk dönemine karşılık gelen birkaç yıldız patlaması amakrin hücresini (SAC’ler) içerir. Evre 2’de (D50-D150 civarında), RO’lar bazı fotoreseptör öncülerini, internöronları ve sinaptogenezle ilgili genleri eksprese eder, bu da bir geçiş aşamasını temsil eder. Fotoreseptörler, insan fetal gelişiminin^{üçüncü aşamasına karşılık gelen evre 3} RO’larda (yaklaşık D100-D150’den sonra) olgunluk geliştirir 6,12,13. Özellikle, aşama 1 ve aşama 2’deki RO’larla karşılaştırıldığında, aşama 3’teki RO’lar, şerit sinapslarının¹⁴ varlığı da dahil olmak üzere, sinapsları^{olgunlaşmış 12} belirgin bir lamel yapıya sahiptir. Ayrıca, yakın zamanda yapılan bir çalışma, olgun sinapsların ışık sinyallerinin iletimi için var olduğunu doğruladı ve bu da işlevsel olduklarını gösteriyor¹³. Bu nedenle, evre 3’teki RO’lar genellikle sinaptik yapıyı araştırmak için seçilir.

İmmünohistokimya, çeşitli moleküler proteinlerin ekspresyonunun incelenmesine yaygın olarak uygulanır. Bununla birlikte, optik mikroskobun sınırlaması, bir seferde yalnızca sınırlı sayıda spesifik hücre ve molekülü gözlemleme yeteneğinde yatmaktadır, bu da hücreler ve çevreleri arasındaki ilişkilerin kapsamlı bir analizinin olmamasına neden olmaktadır. Transmisyon Elektron Mikroskobu (TEM), ışık mikroskobunu ~ 10-20 kat¹⁵ aşan, 0.1-0.2 nm’lik sınırlı bir çözünürlüğe sahip yüksek çözünürlük ile karakterize edilir. Optik mikroskopinin kusurlarını telafi eder ve insanlarda ^16,17 ve çeşitli türlerde ^18,19,20,21 retina gelişimini ve sinaps olgunlaşmasını aydınlatmak için kullanılır. TEM, presinaptik ve postsinaptik bileşenlerin^18,20 doğrudan ayırt edilmesini sağlar ve hatta şeritler ^2,3, veziküller²² ve mitokondri ²³ gibi hücre altı yapıların kapsamlı bir şekilde gözlemlenmesine izin verir. Bu nedenle TEM, sinaps türlerini tanımlamak ve RO’lardaki sinaptik kontakların üst yapısını nano ölçekte keşfetmek için önemli bir araçtır.

Yüksek kaliteli elektron mikrografları elde etmek için numune hazırlamanın büyük önem taşıdığına dikkat etmek çok önemlidir. Bazı çalışmalar RO^12,13,24 üzerinde EM gerçekleştirmiş olsa da, ayrıntılı prosedürler belirsizdir. Elektron mikroskobu görüntüsünün kalitesi büyük ölçüde RO fiksasyonunun ve reaktif geçirgenliğinin etkisine bağlı olduğundan, hazırlık sırasında çeşitli önemli faktörlerin dikkate alınması gerekir. Sonuç olarak, RO’lardaki sinaptik temasları daha iyi araştırmak için, RO fiksasyonu, gömme ve gözlem bölgelerinin tanımlanmasının çalışma noktalarını gösteren iyi tekrarlanabilirliğe sahip bir yöntem sunuyoruz.