הכנת דגימות אורגנואידים ברשתית למיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת
Summary
פרוטוקול זה מספק הליך הכנה אופטימלי ומשוכלל לדגימות אורגנואידים ברשתית למיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. הוא מתאים ליישומים הכוללים ניתוח של סינפסות באורגנואידים רשתית בוגרים.
Abstract
אורגנואידים ברשתית (ROs) הם מערכת תרבית תלת ממדית המחקה תכונות רשתית אנושיות שהתמיינו מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) בתנאים ספציפיים. התפתחות סינפסה והבשלה ב-ROs נחקרו מבחינה אימונוציטוכימית ותפקודית. עם זאת, העדות הישירה לאולטרה-מבנה המגע הסינפטי מוגבלת, ומכילה הן סינפסות סרט מיוחדות והן סינפסות כימיות קונבנציונליות. מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM) מאופיין ברזולוציה גבוהה והיסטוריה מכובדת המבהירה התפתחות רשתית והבשלת סינפסות בבני אדם ומינים שונים. זהו כלי רב עוצמה לחקור מבנה סינפטי ROs והוא נמצא בשימוש נרחב בתחום המחקר של ROs. לכן, כדי לחקור טוב יותר את המבנה של מגעים סינפטיים RO בקנה מידה ננומטרי ולקבל ראיות מיקרוסקופיות באיכות גבוהה, פיתחנו שיטה פשוטה וחוזרת להכנת דגימות RO TEM. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול, ריאגנטים שבהם נעשה שימוש ושלבים מפורטים, כולל הכנת קיבוע RO, קיבוע לאחר קיבוע, הטבעה והדמיה.
Introduction
הרשתית, איבר חישה חזותי חיוני בבני אדם וביונקים, מציגה מבנה למינציה מובהק המאופיין בשלוש שכבות גרעיניות המאחסנות סומות נוירונים ושתי שכבות פרספקס שנוצרו על ידי קשרים סינפטיים1, כולל סינפסות קונבנציונליות וסינפסת הסרט המיוחדת 2,3. סינפסת הסרט ממלאת תפקיד מכריע בהעברת דחפים שלפוחית באופן מדורג 2,3. תהליך הראייה כולל העברת אותות אלקטרו-אופטיים על פני רמות שונות של נוירונים וסינפסות, ובסופו של דבר מגיע לקליפת המוח הראייתית 4,5.
אורגנואידים ברשתית (ROs) מייצגים מערכת תרבית תלת-ממדית (תלת-ממדית) שמקורה בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), המחקים את המצבים הפיזיולוגיים של רקמת הרשתית במבחנה 1,6,7. גישה זו טומנת בחובה הבטחה לחקר מחלות רשתית8, בדיקות סקר תרופתיות9, ומשמשת כטיפול פוטנציאלי למצבים ניווניים בלתי הפיכים ברשתית כגון רטיניטיס פיגמנטוזה10 וגלאוקומה11. כמערכת הולכה אופטית עוצמתית במבחנה, הסינפסה בתוך ROs היא מבנה חיוני המאפשר טרנספורמציה והעברה יעילה של אותות5.
ניתן לחלק את התפתחות RO באופן גס לשלושה שלבים על פי תכונותיהם המורפולוגיות ופרופילי הביטוי המולקולרישלהם 6,12. ROs בשלב 1 (סביב D21-D60) כוללים תאי אב עצביים של הרשתית, תאי גנגליון רשתית רבים (RGCs), וכמה תאים אמקריניים מתפוצצים כוכבים (SACs), המתאימים לתקופה הראשונה של התפתחות עוברית אנושית. בשלב 2 (בסביבות D50-D150), ROs מבטאים כמה מבשרי פוטורצפטור, נוירונים בין-עצביים וגנים הקשורים לסינפטוגנזה, מה שמייצג שלב של מעבר. פוטורצפטורים מפתחים בשלות בשלב 3 ROs (בערך אחרי D100-D150), המתאים לשלב השלישי של התפתחות העובר האנושי 6,12,13. יש לציין כי בהשוואה ל-ROs בשלב 1 ובשלב 2, ל-ROs בשלב 3 יש מבנה למלרי מובהק שהסינפסות שלו הבשילו12, כולל נוכחות של סינפסות סרט14. יתר על כן, מחקר שנערך לאחרונה אישר כי סינפסות בוגרות קיימות העברת אותות אור, המציין שהם פונקציונליים13. לכן, ROs בשלב 3 נבחרים לעתים קרובות לחקור את המבנה הסינפטי.
אימונוהיסטוכימיה מיושמת באופן נרחב לחקר הביטוי של חלבונים מולקולריים שונים. עם זאת, המגבלה של המיקרוסקופ האופטי טמונה ביכולתו לצפות רק במספר מוגבל של תאים ומולקולות ספציפיים בו זמנית, וכתוצאה מכך חוסר ניתוח מקיף של היחסים בין תאים לסביבתם. מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM) מאופיין ברזולוציה גבוהה, עם רזולוציה מוגבלת של 0.1-0.2 ננומטר, עולה על מיקרוסקופ האור על ידי ~ 10-20 פעמים15. הוא מפצה על הפגמים של מיקרוסקופיה אופטית ומשמש להבהרת התפתחות הרשתית והבשלת סינפסות בבני אדם16,17 ומינים שונים18,19,20,21. TEM מאפשר הבחנה ישירה בין רכיבים קדם-סינפטיים ופוסט-סינפטיים18,20, ואף מאפשר תצפית מקיפה על מבנים תת-תאיים כגון סרטים 2,3, שלפוחיות22 ומיטוכונדריה23. לכן, TEM הוא כלי חיוני לזיהוי סוגי סינפסות וחקירת מבנה העל של מגעים סינפטיים ב- ROs בקנה מידה ננומטרי.
חשוב לציין כי להכנת הדגימה חשיבות רבה לרכישת מיקרוגרפים אלקטרונים איכותיים. למרות שמחקרים מסוימים ביצעו EM על ROs 12,13,24, ההליכים המפורטים אינם ברורים. מכיוון שאיכות תמונת מיקרוסקופ האלקטרונים תלויה במידה רבה בהשפעה של קיבוע RO וחדירת מגיב, יש לקחת בחשבון גורמים חשובים שונים במהלך ההכנה. כתוצאה מכך, כדי לחקור טוב יותר מגעים סינפטיים ב-ROs, אנו מציגים שיטה עם יכולת שחזור טובה שמראה את נקודות הפעולה של קיבוע RO, הטבעה וזיהוי של אתרי תצפית.
Protocol
Representative Results
Discussion
במאמר זה, הצגנו פרוטוקול מפורט לצפייה באולטרה-מבנה קונבנציונלי וסינפטי של הסרט ב-ROs על ידי TEM. פרוטוקול זה מבוסס על שיטות הכנת הרשתית שתוארו לעיל עם כמה שינויים20. כדי לשפר את שיעור ההצלחה של הטיפול בדגימה ואת האיכות של מיקרוגרפים TEM, שקול את נקודות המפתח הבאות….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקים מהתוכנית הלאומית למחקר ופיתוח מפתח של סין (2022YFA1105503), מעבדת המפתח הממלכתית למדעי המוח (SKLN-202103), קרן ג’ג’יאנג למדעי הטבע של סין (Y21H120019), הקרן למדעי הטבע של סין (82070981).
Materials
| 100 mm Petri dish | Corning | 430167 | |
| Acetone | Electron Microscopy Science | 10000 | |
| B27 supplement | Gibco | A3582801 | |
| Cell lifter | Santa Cruz | sc-395251 | |
| Copper grids | Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd. | AZH400HH | |
| DigitalMicrograph Software | Gatan, Inc. | Software | |
| Dispase | StemCell Technologies | #07913 | Bacterial protease |
| DMEM/F12 medium | Gibco | #11320033 | |
| Embedding mold | Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd. | GZ10592 | |
| Epon-812 resin | Electron Microscopy Science | #14900 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biological Industries | #04-0021A | |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Science | 16020 | |
| hiPSC | Shownin Biotechnology Co. Ltd. | RC01001-A | |
| Lead citrate | Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd. | GZ02618 | |
| L-GlutaMax | Life Technologies | #35050061 | L-glutamine substitute |
| Matrigel | Corning | 356234 | |
| Microscope slide | CITOTEST | 80312-3161 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| Na2HPO4· 12H2O | Sigma | 71650 | A component of PB/PBS |
| NaH2PO4· H2O | Sigma | 71507 | A component of PB/PBS |
| Non-essential amino acids | Sigma | #M7145 | |
| Optical microscope | Lab Binocular Biological Microscope | Xsz-107bnii | |
| OsO4 | TED PELLA | 4008-160501 | |
| Oven | Bluepard | BPG9040A | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 157-8 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | #15140-122 | |
| Semi/ultrathin microtome | Reichert-Jung | 396649 | |
| Taurine | Sigma | #T0625 | |
| Toluidine blue | Sangon Biotech | E670105-0100 | |
| Transmission Electron Microscopes | HITACHI | H-7500 | |
| Uranyl acetate | TED PELLA | CA96049 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | 444203 |
References
- Andreazzoli, M., Barravecchia, I., De Cesari, C., Angeloni, D., Demontis, G. C. Inducible pluripotent stem cells to model and treat inherited degenerative diseases of the outer retina: 3d-organoids limitations and bioengineering solutions. Cells. 10 (9), 2489 (2021).
- Moser, T., Grabner, C. P., Schmitz, F. Sensory processing at ribbon synapses in the retina and the cochlea. Physiol Rev. 100 (1), 103-144 (2020).
- Tom Dieck, S., Brandstätter, J. H. Ribbon synapses of the retina. Cell Tissue Res. 326 (2), 339-346 (2006).
- Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. . Webvision: The organization of the retina and visual. , (1995).
- Soto, F., Zhao, L., Kerschensteiner, D. Synapse maintenance and restoration in the retina by ngl2. Elife. 7, e30388 (2018).
- Kruczek, K., Swaroop, A. Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies. Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).
- O’Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: A window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
- Norrie, J. L., et al. Retinoblastoma from human stem cell-derived retinal organoids. Nat Commun. 12 (1), 4535 (2021).
- Luni, C., Serena, E., Elvassore, N. Human-on-chip for therapy development and fundamental science. Curr Opin Biotechnol. 25, 45-50 (2014).
- Chahine Karam, F., et al. Human ipsc-derived retinal organoids and retinal pigment epithelium for novel intronic rpgr variant assessment for therapy suitability. J Pers Med. 12 (3), 502 (2022).
- Lo, J., et al. Therapeutic strategies for glaucoma and optic neuropathies. Mol Aspects Med. 94, 101219 (2023).
- Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3d human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), 171686 (2019).
- Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
- Cora, V., et al. A cleared view on retinal organoids. Cells. 8 (5), 391 (2019).
- Żak, A. M. Light-induced in situ transmission electron microscopy─development, challenges, and perspectives. Nano Lett. 22 (23), 9219-9226 (2022).
- Tschulakow, A. V., Oltrup, T., Bende, T., Schmelzle, S., Schraermeyer, U. The anatomy of the foveola reinvestigated. PeerJ. 6, e4482 (2018).
- Syrbe, S., et al. Müller glial cells of the primate foveola: An electron microscopical study. Exp Eye Res. 167, 110-117 (2018).
- Xiao, J., et al. Rod bipolar cells receive cone photoreceptor inputs through both invaginating synapses and flat contacts in the mouse and guinea pig retinas. J Comp Neurol. 531 (11), 1184-1197 (2023).
- Liu, X., et al. Retinal degeneration in rpgra mutant zebrafish. Front Cell Dev Biol. 11, 1169941 (2023).
- Yang, Q., et al. Expression of α-synuclein in the mouse retina is confined to inhibitory presynaptic elements. J Comp Neurol. 531 (10), 1057-1079 (2023).
- Zhang, J., et al. Early degeneration of photoreceptor synapse in ccl2/cx3cr1-deficient mice on crb1(rd8) background. Synapse. 67 (8), 515-531 (2013).
- De Robertis, E., Franchi, C. M. Electron microscope observations on synaptic vesicles in synapses of the retinal rods and cones. J Biophys Biochem Cytol. 2 (3), 307-318 (1956).
- Frey, T. G., Mannella, C. A. The internal structure of mitochondria. Trends Biochem Sci. 25 (7), 319-324 (2000).
- Gonzalez-Cordero, A., et al. Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors. Stem Cell Reports. 9 (3), 820-837 (2017).
- Gao, M. L., et al. Patient-specific retinal organoids recapitulate disease features of late-onset retinitis pigmentosa. Front Cell Dev Biol. 8, 128 (2020).
- Afanasyeva, T. a. V., et al. A look into retinal organoids: Methods, analytical techniques, and applications. Cell Mol Life Sci. 78 (19-20), 6505-6532 (2021).
