Preparazione di campioni di organoidi retinici per la microscopia elettronica a trasmissione

La retina, un organo sensoriale visivo vitale nell’uomo e nei mammiferi, mostra una struttura laminata distinta caratterizzata da tre strati nucleari che ospitano somi neuronali e due strati plessiformi formati da connessioni sinaptiche¹, comprese le sinapsi convenzionali e la sinapsi a nastro specializzata ^2,3. La sinapsi a nastro svolge un ruolo cruciale nella trasmissione degli impulsi delle vescicole in modo graduale ^2,3. Il processo visivo coinvolge la trasmissione del segnale elettro-ottico attraverso vari livelli di neuroni e sinapsi, raggiungendo infine la corteccia visiva ^4,5.

Gli organoidi retinici (RO) rappresentano un sistema di coltura tridimensionale (3D) derivato da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), che imita gli stati fisiologici del tessuto retinico in vitro ^1,6,7. Questo approccio è promettente per lo studio delle malattie retiniche⁸, lo screening farmacologico⁹ e funge da potenziale terapia per le condizioni degenerative retiniche irreversibili come la retinite pigmentosa¹⁰ e il glaucoma¹¹. Essendo un potente sistema di conduzione ottica in vitro, la sinapsi all’interno delle RO è una struttura cruciale che facilita l’efficace trasformazione e trasferimento del segnale⁵.

Lo sviluppo dell’RO può essere approssimativamente suddiviso in tre fasi in base ai loro tratti morfologici e profili di espressione molecolare ^6,12. Le RO allo stadio 1 (circa D21-D60) comprendono cellule progenitrici neurali della retina, molte cellule gangliari retiniche (RGC) e alcune cellule amacrine starburst (SAC), corrispondenti alla prima epoca dello sviluppo fetale umano. Nello stadio 2 (circa D50-D150), gli RO esprimono alcuni precursori dei fotorecettori, interneuroni e geni correlati alla sinaptogenesi, che rappresenta una fase di transizione. I fotorecettori sviluppano la maturità nello stadio 3 delle RO (circa dopo D100-D150), corrispondente al terzo stadio dello sviluppo fetale umano ^6,12,13. In particolare, rispetto alle RO dello stadio 1 e dello stadio 2, le RO dello stadio 3 hanno una struttura lamellare distinta le cui sinapsi sono maturate¹², inclusa la presenza di sinapsi a nastro¹⁴. Inoltre, un recente studio ha confermato che le sinapsi mature esistono nella trasmissione di segnali luminosi, indicando che sono funzionali¹³. Pertanto, le RO allo stadio 3 sono spesso selezionate per studiare la struttura sinaptica.

L’immunoistochimica è ampiamente applicata allo studio dell’espressione di varie proteine molecolari. Tuttavia, il limite della microscopia ottica risiede nella sua capacità di osservare solo un numero limitato di cellule e molecole specifiche alla volta, con conseguente mancanza di un’analisi completa delle relazioni tra le cellule e l’ambiente circostante. La microscopia elettronica a trasmissione (TEM) è caratterizzata da un’alta risoluzione, con una risoluzione limitata di 0,1-0,2 nm, superando il microscopio ottico di ~10-20 volte¹⁵. Compensa i difetti della microscopia ottica e viene utilizzato per chiarire lo sviluppo della retina e la maturazione delle sinapsi nell’uomo^16,17 e in varie specie 18,19,20,21. La TEM consente la distinzione diretta delle componenti presinaptiche e postsinaptiche^18,20 e consente anche l’osservazione completa di strutture subcellulari come i nastri ^2,3, le vescicole²² e i mitocondri²³. Pertanto, la TEM è uno strumento essenziale per identificare i tipi di sinapsi ed esplorare l’ultrastruttura dei contatti sinaptici nelle RO su scala nanometrica.

È fondamentale notare che la preparazione del campione è di grande importanza per l’acquisizione di micrografie elettroniche di alta qualità. Sebbene alcuni studi abbiano eseguito EM su RO 12,13,24, le procedure dettagliate non sono chiare. Poiché la qualità dell’immagine al microscopio elettronico dipende in larga misura dall’effetto della fissazione RO e della permeazione del reagente, durante la preparazione è necessario considerare vari fattori importanti. Di conseguenza, per studiare meglio i contatti sinaptici nelle RO, presentiamo un metodo con una buona riproducibilità che mostra i punti operativi del fissaggio, dell’inclusione e dell’identificazione dei siti di osservazione delle RO.