Préparation d’échantillons d’organoïdes rétiniens pour la microscopie électronique à transmission

La rétine, un organe sensoriel visuel vital chez l’homme et les mammifères, présente une structure laminée distincte caractérisée par trois couches nucléaires abritant des somas neuronaux et deux couches plexiformes formées par des connexions synaptiques¹, y compris les synapses conventionnelles et la synapse de ruban spécialisée ^2,3. La synapse du ruban joue un rôle crucial dans la transmission des impulsions des vésicules de manière graduée ^2,3. Le processus de vision implique la transmission de signaux électro-optiques à travers différents niveaux de neurones et de synapses, atteignant finalement le cortex visuel ^4,5.

Les organoïdes rétiniens (OI) représentent un système de culture tridimensionnel (3D) dérivé de cellules souches pluripotentes induites (CSPi), imitant les états physiologiques du tissu rétinien in vitro ^1,6,7. Cette approche est prometteuse pour l’étude des maladies de la rétine⁸, le dépistage de médicaments⁹ et la thérapie potentielle pour les maladies dégénératives irréversibles de la rétine telles que la rétinite pigmentaire¹⁰ et le glaucome¹¹. En tant que puissant système de conduction optique in vitro, la synapse au sein des RO est une structure cruciale facilitant la transformation et le transfert efficaces du signal⁵.

Le développement de l’OI peut être grossièrement divisé en trois étapes en fonction de leurs caractéristiques morphologiques et de leurs profils d’expression moléculaire ^6,12. Les OI au stade 1 (autour de D21-D60) comprennent des cellules progénitrices neurales de la rétine, de nombreuses cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR) et quelques cellules amacrines en étoile (SAC), correspondant à la première époque du développement fœtal humain. Au stade 2 (vers D50-D150), les RO expriment certains précurseurs de photorécepteurs, interneurones et gènes liés à la synaptogenèse, ce qui représente une phase de transition. Les photorécepteurs développent leur maturité au stade 3 des RO (environ après J100-D150), correspondant au troisième stade du développement du fœtus humain ^6,12,13. Notamment, par rapport aux RO de stade 1 et 2, les RO de stade 3 ont une structure lamellaire distincte dont les synapses ont mûri¹², y compris la présence de synapses rubanées¹⁴. De plus, une étude récente a confirmé que les synapses matures existent pour la transmission de signaux lumineux, indiquant qu’elles sont fonctionnelles¹³. Ainsi, les OI au stade 3 sont souvent sélectionnées pour étudier la structure synaptique.

L’immunohistochimie est largement appliquée à l’étude de l’expression de diverses protéines moléculaires. Cependant, la limite de la microscopie optique réside dans sa capacité à n’observer qu’un nombre restreint de cellules et de molécules spécifiques à la fois, ce qui entraîne un manque d’analyse complète des relations entre les cellules et leur environnement. La microscopie électronique à transmission (MET) se caractérise par une haute résolution, avec une résolution limitée de 0,1 à 0,2 nm, surpassant le microscope optique de ~10 à 20 fois¹⁵. Il compense les défauts de la microscopie optique et est utilisé pour élucider le développement rétinien et la maturation des synapses chez l’homme^16,17 et diverses espèces 18,19,20,21. La MET permet de distinguer directement les composants présynaptiques et postsynaptiques^18,20, et permet même l’observation complète de structures subcellulaires telles que les rubans ^2,3, les vésicules²² et les mitochondries²³. Par conséquent, la MET est un outil essentiel pour identifier les types de synapses et explorer l’ultrastructure des contacts synaptiques dans les OI à l’échelle nanométrique.

Il est crucial de noter que la préparation des échantillons est d’une grande importance pour l’acquisition de micrographies électroniques de haute qualité. Bien que certaines études aient effectué une EM sur les OI^{12, 13, 24}, les procédures détaillées ne sont pas claires. Étant donné que la qualité de l’image de microscopie électronique dépend dans une large mesure de l’effet de la fixation de l’OI et de la perméation du réactif, divers facteurs importants doivent être pris en compte lors de la préparation. Par conséquent, pour mieux étudier les contacts synaptiques dans les OI, nous présentons une méthode avec une bonne reproductibilité qui montre les points de fonctionnement de la fixation, de l’intégration et de l’identification des sites d’observation.