Подготовка образцов органоидов сетчатки для просвечивающей электронной микроскопии

Сетчатка, жизненно важный орган зрительной чувствительности у человека и млекопитающих, имеет отчетливую слоистую структуру, характеризующуюся тремя ядерными слоями, содержащими нейронные сомы, и двумя плексиформными слоями, образованными синаптическими связями¹, включая обычные синапсы и специализированный ленточный синапс ^2,3. Ленточный синапс играет решающую роль в передаче импульсов везикул в постепенном порядке ^2,3. Процесс зрения включает в себя передачу электрооптического сигнала через различные уровни нейронов и синапсов, в конечном итоге достигая зрительной коры ^4,5.

Органоиды сетчатки (РО) представляют собой трехмерную (3D) культуральную систему, полученную из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), имитирующую физиологические состояния ткани сетчатки in vitro ^1,6,7. Этот подход является перспективным для изучения заболеваний сетчатки⁸, скрининга лекарств⁹ и служит потенциальной терапией для необратимых дегенеративных состояний сетчатки, таких как пигментный ретинит¹⁰ и глаукома¹¹. Являясь мощной системой оптической проводимости in vitro, синапс в АФ является важнейшей структурой, способствующей эффективному преобразованию и передаче сигнала^.

Развитие ОО можно условно разделить на три стадии в соответствии с их морфологическими признаками и профилями молекулярной экспрессии ^6,12. RO на стадии 1 (около D21-D60) включают в себя нервные клетки-предшественники сетчатки, множество ганглиозных клеток сетчатки (RGC) и несколько звездообразных амакриновых клеток (SAC), соответствующих первой эпохе развития плода человека. На стадии 2 (около D50-D150) RO экспрессируют некоторые предшественники фоторецепторов, интернейроны и гены, связанные с синаптогенезом, что представляет собой фазу перехода. Фоторецепторы развивают зрелость на стадии 3 RO (примерно после D100-D150), что соответствует третьей стадии развития плода человека ^6,12,13. Примечательно, что по сравнению с АФ на стадии 1 и стадии 2, РО на стадии 3 имеют отчетливую пластинчатую структуру, синапсы которой созрели¹², включая наличие ленточных синапсов¹⁴. Более того, недавнее исследование подтвердило, что зрелые синапсы существуют для передачи световых сигналов, что указывает на^{их функциональность.} Таким образом, АФ на стадии 3 часто отбираются для исследования синаптической структуры.

Иммуногистохимия широко применяется для изучения экспрессии различных молекулярных белков. Тем не менее, ограничение оптической микроскопии заключается в ее способности наблюдать только ограниченное количество конкретных клеток и молекул одновременно, что приводит к отсутствию всестороннего анализа взаимоотношений между клетками и окружающей их средой. Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) характеризуется высоким разрешением, с ограниченным разрешением 0,1-0,2 нм, превосходящим световой микроскоп в ~10-20 раз^{в 15} раз. Он восполняет дефекты оптической микроскопии и используется для выяснения развития сетчатки и созревания синапсов у человека^16,17 и различных видов 18,19,20,21. ПЭМ позволяет проводить прямое различие между пресинаптическими и постсинаптическими компонентами^18,20 и даже позволяет всесторонне наблюдать за субклеточными структурами, такими как ленты ^2,3, везикулы²² и митохондрии²³. Таким образом, ПЭМ является важным инструментом для идентификации типов синапсов и изучения ультраструктуры синаптических контактов в РО на наноуровне.

Важно отметить, что пробоподготовка имеет большое значение для получения высококачественных электронных микрофотографий. Хотя в некоторых исследованиях ЭМ выполняли на RO 12,13,24, подробные процедуры неясны. Поскольку качество изображения электронной микроскопии в значительной степени зависит от эффекта фиксации RO и проникновения реагента, при подготовке необходимо учитывать различные важные факторы. Следовательно, для лучшего исследования синаптических контактов в РО мы представляем метод с хорошей воспроизводимостью, который показывает рабочие точки фиксации, встраивания и идентификации мест наблюдения РО.