Voorbereiding van retinale organoïdemonsters voor transmissie-elektronenmicroscopie

Het netvlies, een vitaal visueel sensorisch orgaan bij mensen en zoogdieren, vertoont een duidelijke gelamineerde structuur die wordt gekenmerkt door drie nucleaire lagen met neuron somas en twee plexiforme lagen gevormd door synaptische verbindingen¹, waaronder conventionele synapsen en de gespecialiseerde lintsynaps ^2,3. De lintsynaps speelt een cruciale rol bij het gradueel overbrengen van blaasjesimpulsen ^2,3. Het visieproces omvat elektro-optische signaaloverdracht over verschillende niveaus van neuronen en synapsen, die uiteindelijk de visuele cortex bereiken ^4,5.

Retinale organoïden (RO’s) vertegenwoordigen een driedimensionaal (3D) kweeksysteem dat is afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC’s), dat de fysiologische toestanden van netvliesweefsel in vitro nabootst ^1,6,7. Deze benadering is veelbelovend voor het bestuderen van netvliesaandoeningen⁸, medicamenteuze screening⁹ en dient als een mogelijke therapie voor onomkeerbare retinale degeneratieve aandoeningen zoals retinitis pigmentosa¹⁰ en glaucoom¹¹. Als een krachtig in vitro optisch geleidingssysteem is de synaps in RO’s een cruciale structuur die effectieve signaaltransformatie en -overdracht mogelijk^{maakt 5}.

De ontwikkeling van RO kan grofweg in drie fasen worden verdeeld, afhankelijk van hun morfologische kenmerken en moleculaire expressieprofielen ^6,12. RO’s in stadium 1 (rond D21-D60) omvatten neurale voorlopercellen van het netvlies, veel retinale ganglioncellen (RGC’s) en enkele starburst-amacriene cellen (SAC’s), die overeenkomen met het eerste tijdperk van de ontwikkeling van de menselijke foetus. In stadium 2 (rond D50-D150) brengen RO’s enkele fotoreceptorvoorlopers, interneuronen en synaptogenese-gerelateerde genen tot expressie, wat een overgangsfase vertegenwoordigt. Fotoreceptoren ontwikkelen rijpheid in stadium 3 RO’s (ongeveer na D100-D150), wat overeenkomt met de derde fase van de menselijke foetale ontwikkeling ^6,12,13. Met name in vergelijking met RO’s in fase 1 en fase 2 hebben RO’s in fase 3 een duidelijke lamellaire structuur waarvan de synapsen zijn gerijpt¹², inclusief de aanwezigheid van lintsynapsen¹⁴. Bovendien heeft een recente studie bevestigd dat de volwassen synapsen bestaan de overdracht van lichtsignalen, wat aangeeft dat ze functioneel zijn¹³. Daarom worden RO’s in fase 3 vaak geselecteerd om de synaptische structuur te onderzoeken.

Immunohistochemie wordt veel toegepast bij de studie van de expressie van verschillende moleculaire eiwitten. De beperking van optische microscopie ligt echter in het vermogen om slechts een beperkt aantal specifieke cellen en moleculen tegelijk waar te nemen, wat resulteert in een gebrek aan uitgebreide analyse van de relaties tussen cellen en hun omgeving. Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) wordt gekenmerkt door een hoge resolutie, met een beperkte resolutie van 0,1-0,2 nm, die de lichtmicroscoop met ~10-20 keer¹⁵ overtreft. Het compenseert de defecten van optische microscopie en wordt gebruikt om de ontwikkeling van het netvlies en de rijping van synapsen bij mensen op te helderen^16,17 en verschillende soorten 18,19,20,21. TEM maakt het directe onderscheid tussen presynaptische en postsynaptische componenten^{mogelijk 18,20}, en maakt zelfs uitgebreide observatie mogelijk van subcellulaire structuren zoals linten ^2,3, blaasjes²² en mitochondriën²³. Daarom is TEM een essentieel hulpmiddel voor het identificeren van soorten synapsen en het verkennen van de ultrastructuur van synaptische contacten in RO’s op nanoschaal.

Het is van cruciaal belang op te merken dat monstervoorbereiding van groot belang is voor het verkrijgen van hoogwaardige elektronenmicrofoto’s. Hoewel sommige studies EM hebben uitgevoerd op RO’s 12,13,24, zijn de gedetailleerde procedures onduidelijk. Aangezien de kwaliteit van het elektronenmicroscopiebeeld in grote mate afhangt van het effect van RO-fixatie en reagenspermeatie, moet bij de voorbereiding met verschillende belangrijke factoren rekening worden gehouden. Om synaptische contacten in RO’s beter te onderzoeken, presenteren we daarom een methode met een goede reproduceerbaarheid die de werkingspunten van RO-fixatie, inbedding en de identificatie van observatieplaatsen aantoont.