Vorbereitung von retinalen Organoidproben für die Transmissionselektronenmikroskopie

Die Netzhaut, ein lebenswichtiges visuelles Sinnesorgan bei Menschen und Säugetieren, weist eine ausgeprägte laminierte Struktur auf, die durch drei Kernschichten gekennzeichnet ist, in denen Neuronensomas untergebracht sind, und zwei plexiforme Schichten, die durch synaptische Verbindungen^{gebildet werden 1}, einschließlich konventioneller Synapsen und der spezialisierten Bandsynapse ^2,3. Die Bandsynapse spielt eine entscheidende Rolle bei der abgestuften Übertragung von Vesikelimpulsen ^2,3. Der Sehprozess umfasst die elektrooptische Signalübertragung über verschiedene Ebenen von Neuronen und Synapsen, die schließlich den visuellen Kortex erreicht ^4,5.

Retinale Organoide (ROs) stellen ein dreidimensionales (3D) Kultursystem dar, das aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) gewonnen wird und die physiologischen Zustände von Netzhautgewebe in vitro nachahmt ^1,6,7. Dieser Ansatz ist vielversprechend für die Untersuchung von Netzhauterkrankungen⁸, das Wirkstoffscreening⁹ und als potenzielle Therapie für irreversible degenerative Netzhauterkrankungen wie Retinitis pigmentosa¹⁰ und Glaukom¹¹. Als leistungsfähiges optisches In-vitro-Leitungssystem ist die Synapse in ROs eine entscheidende Struktur, die eine effektive Signaltransformation und -übertragung ermöglicht⁵.

Die Entwicklung der Umkehrosmose kann grob in drei Stadien eingeteilt werden, die sich nach ihren morphologischen Merkmalen und molekularen Expressionsprofilen^{richten 6,12}. ROs im Stadium 1 (um D21-D60) bestehen aus neuralen Vorläuferzellen der Netzhaut, vielen retinalen Ganglienzellen (RGCs) und einigen Starburst-Amakrinzellen (SACs), was der ersten Epoche der menschlichen fetalen Entwicklung entspricht. Im Stadium 2 (um D50-D150) exprimieren ROs einige Photorezeptorvorläufer, Interneuronen und Synaptogenese-bezogene Gene, was eine Übergangsphase darstellt. Photorezeptoren entwickeln ihre Reife im Stadium 3 ROs (etwa nach D100-D150), was dem dritten Stadium der fetalen Entwicklung des Menschen entspricht ^6,12,13. Bemerkenswert ist, dass ROs im Stadium 3 im Vergleich zu ROs in Stadium 1 und Stadium 2 eine ausgeprägte lamelläre Struktur aufweisen, deren Synapsen gereift sind¹², einschließlich des Vorhandenseins von Bandsynapsen¹⁴. Darüber hinaus hat eine kürzlich durchgeführte Studie bestätigt, dass die reifen Synapsen die Übertragung von Lichtsignalen ermöglichen, was darauf hindeutet, dass sie funktionsfähig sind¹³. Daher werden ROs im Stadium 3 oft ausgewählt, um die synaptische Struktur zu untersuchen.

Die Immunhistochemie wird häufig zur Untersuchung der Expression verschiedener molekularer Proteine eingesetzt. Die Einschränkung der optischen Mikroskopie liegt jedoch in ihrer Fähigkeit, nur eine begrenzte Anzahl spezifischer Zellen und Moleküle gleichzeitig zu beobachten, was dazu führt, dass die Beziehungen zwischen Zellen und ihrer Umgebung nicht umfassend analysiert werden können. Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) zeichnet sich durch eine hohe Auflösung mit einer begrenzten Auflösung von 0,1-0,2 nm aus und übertrifft das Lichtmikroskop um ~10-20 mal¹⁵. Es gleicht die Defekte der optischen Mikroskopie aus und wird zur Aufklärung der Netzhautentwicklung und Synapsenreifung beim Menschen^16,17 und verschiedenen Spezies^{verwendet 18,19,20,21}. TEM ermöglicht die direkte Unterscheidung von präsynaptischen und postsynaptischen Komponenten^18,20 und ermöglicht sogar eine umfassende Beobachtung subzellulärer Strukturen wie Bänder ^2,3, Vesikel²² und Mitochondrien²³. Daher ist TEM ein wesentliches Werkzeug zur Identifizierung von Synapsentypen und zur Erforschung der Ultrastruktur synaptischer Kontakte in ROs auf der Nanoskala.

Es ist wichtig zu beachten, dass die Probenvorbereitung von großer Bedeutung ist, um qualitativ hochwertige elektronenmikroskopische Aufnahmen zu erhalten. Obwohl einige Studien EM an ROs durchgeführt haben 12,13,24, sind die detaillierten Verfahren unklar. Da die Qualität des elektronenmikroskopischen Bildes in hohem Maße vom Effekt der RO-Fixierung und der Reagenzienpermeation abhängt, müssen bei der Präparation verschiedene wichtige Faktoren berücksichtigt werden. Um die synaptischen Kontakte in ROs besser untersuchen zu können, stellen wir daher eine Methode mit guter Reproduzierbarkeit vor, die die Operationspunkte der RO-Fixierung, Einbettung und Identifizierung von Beobachtungsstellen zeigt.