透過型電子顕微鏡法のためのレチナールオルガノイドサンプルの調製

ヒトや哺乳類の重要な視覚感覚器官である網膜は、ニューロン体細胞を収容する3つの核層^{と、従来の}シナプスと特殊なリボンシナプス^2,3を含むシナプス結合1によって形成される2つのフジツ状層を特徴とする明確な積層構造を示しています。リボンシナプスは、小胞のインパルスを段階的に伝達する上で重要な役割を果たします^2,3。視覚プロセスには、さまざまなレベルのニューロンとシナプスにわたる電気光学信号の伝達が含まれ、最終的には視覚野^{に到達します4,5}。

レチナールオルガノイド(RO)は、人工多能性幹細胞(iPSC)に由来する三次元(3D)培養システムであり、in vitroで網膜組織の生理学的状態を模倣しています^1,6,7。このアプローチは、網膜疾患の研究⁸、薬物スクリーニング⁹、網膜色素変性症¹⁰や緑内障¹¹などの不可逆的な網膜変性疾患の潜在的な治療法として役立つことが期待されています。強力なin vitro光学伝導システムとして、RO内のシナプスは効果的なシグナル変換と伝達を促進する重要な構造です⁵。

ROの発生は、その形態学的形質および分子^{発現プロファイル6,12}に応じて、大きく3つの段階に分けることができる。ステージ1(D21-D60付近)のROは、網膜の神経前駆細胞、多くの網膜神経節細胞(RGC)、および少数のスターバーストアマクリン細胞(SAC)で構成され、ヒト胎児の発育の最初のエポックに対応します。ステージ2(D50-D150付近)では、ROは一部の光受容体前駆体、介在ニューロン、および移行期を表すシナプス形成関連遺伝子を発現します。光受容体は、ヒト胎児の発育の第3段階に対応するステージ3のRO(D100-D150の後頃)で成熟します^6,12,13。注目すべきは、ステージ1およびステージ2のROと比較して、ステージ3のROは、リボンシナプス¹⁴の存在を含む、シナプスが成熟した明確なラメラ構造¹²を有する。さらに、最近の研究では、成熟したシナプスが光信号の透過性に存在することが確認されており、それらが機能的であることが示されています¹³。したがって、ステージ3のROは、シナプス構造を調査するために選択されることがよくあります。

免疫組織化学は、さまざまな分子タンパク質の発現の研究に広く応用されています。しかし、光学顕微鏡の限界は、一度に限られた数の特定の細胞や分子しか観察できないため、細胞とその周辺環境との関係を包括的に解析することができません。透過型電子顕微鏡(TEM)は、0.1〜0.2 nmの限られた分解能で、光学顕微鏡を¹⁵倍~10〜20倍上回る高解像度を特徴としています。光学顕微鏡の欠点を補うもので、ヒト^16,17や種^々の種18,19,20,21における網膜の発達とシナプスの成熟を解明するために用いられている。TEMは、シナプス前成分とシナプス後成分^18,20を直接区別することを可能にし、さらにはリボン^2,3、小胞²²、ミトコンドリア²³などの細胞内構造の包括的な観察も可能にする。したがって、TEMは、シナプスの種類を特定し、ナノスケールでROのシナプス接触の超微細構造を探索するために不可欠なツールです。

サンプル調製は、高品質の電子顕微鏡写真を取得するために非常に重要であることに注意することが重要です。いくつかの研究では、RO12,13,24に対してEMを実施しましたが、詳細な手順は不明です。電子顕微鏡の画像品質は、ROの固定と試薬の透過の影響に大きく依存するため、調製時にはさまざまな重要な要素を考慮する必要があります。したがって、ROのシナプス接触をよりよく調べるために、ROの固定、埋め込み、および観察部位の同定の操作点を示す再現性の良い方法を提示します。