Preparación de muestras de organoides de retina para microscopía electrónica de transmisión

La retina, un órgano sensorial visual vital en humanos y mamíferos, exhibe una estructura laminada distinta caracterizada por tres capas nucleares que albergan somas neuronales y dos capas plexiformes formadas por conexiones sinápticas¹, incluidas las sinapsis convencionales y la sinapsis de cinta especializada ^2,3. La sinapsis en cinta desempeña un papel crucial en la transmisión de los impulsos vesicular de forma gradual ^2,3. El proceso de visión implica la transmisión de señales electroópticas a través de varios niveles de neuronas y sinapsis, llegando finalmente a la corteza visual ^4,5.

Los organoides de la retina (ROs) representan un sistema de cultivo tridimensional (3D) derivado de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs), que imitan los estados fisiológicos del tejido retiniano in vitro ^1,6,7. Este enfoque es prometedor para el estudio de las enfermedades de la retina⁸, el cribado de fármacos⁹ y sirve como una terapia potencial para las enfermedades degenerativas irreversibles de la retina, como la retinosis pigmentaria¹⁰ y el glaucoma¹¹. Como potente sistema de conducción óptica in vitro, la sinapsis dentro de las RO es una estructura crucial que facilita la transformación y transferencia efectivas de la señal⁵.

A grandes rasgos, el desarrollo de la RO puede dividirse en tres etapas según sus rasgos morfológicos y perfiles de expresión molecular ^6,12. Las RO en la etapa 1 (alrededor de D21-D60) comprenden células progenitoras neurales de la retina, muchas células ganglionares de la retina (RGC) y algunas células amacrinas (SAC), correspondientes a la primera época del desarrollo fetal humano. En la etapa 2 (alrededor de D50-D150), las RO expresan algunos precursores de fotorreceptores, interneuronas y genes relacionados con la sinaptogénesis, lo que representa una fase de transición. Los fotorreceptores desarrollan la madurez en la etapa 3 de ROs (alrededor de después de D100-D150), correspondiente a la tercera etapa del desarrollo fetal humano ^6,12,13. En particular, en comparación con las RO en la etapa 1 y la etapa 2, las RO en la etapa 3 tienen una estructura laminar distinta cuyas sinapsis han madurado¹², incluida la presencia de sinapsis en cinta¹⁴. Además, un estudio reciente ha confirmado que las sinapsis maduras existen para la transmisión de señales luminosas, lo que indica que son funcionales¹³. Por lo tanto, las RO en la etapa 3 a menudo se seleccionan para investigar la estructura sináptica.

La inmunohistoquímica se aplica ampliamente al estudio de la expresión de diversas proteínas moleculares. Sin embargo, la limitación de la microscopía óptica radica en su capacidad para observar solo un número restringido de células y moléculas específicas a la vez, lo que resulta en una falta de análisis exhaustivo de las relaciones entre las células y su entorno circundante. La microscopía electrónica de transmisión (TEM) se caracteriza por una alta resolución, con una resolución limitada de 0,1-0,2 nm, superando al microscopio óptico en ~10-20 veces¹⁵. Compensa los defectos de la microscopía óptica y se utiliza para dilucidar el desarrollo de la retina y la maduración de las sinapsis en humanos^16,17 y diversas especies 18,19,20,21. La TEM permite la distinción directa de los componentes presinápticos y postsinápticos^18,20, e incluso permite la observación exhaustiva de estructuras subcelulares como las cintas ^2,3, las vesículas²² y las mitocondrias²³. Por lo tanto, TEM es una herramienta esencial para identificar tipos de sinapsis y explorar la ultraestructura de los contactos sinápticos en RO a nanoescala.

Es crucial tener en cuenta que la preparación de la muestra es de gran importancia para adquirir micrografías electrónicas de alta calidad. Aunque algunos estudios han realizado EM en ROs 12,13,24, los procedimientos detallados no están claros. Dado que la calidad de la imagen de microscopía electrónica depende en gran medida del efecto de la fijación de la ósmosis inversa y la permeabilidad del reactivo, es necesario tener en cuenta varios factores importantes durante la preparación. En consecuencia, para investigar mejor los contactos sinápticos en las RO, presentamos un método con buena reproducibilidad que muestra los puntos de operación de la fijación de la RO, la inclusión y la identificación de los sitios de observación.