Исследование контуров сетчатки и молекулярной локализации с помощью иммуноэлектронной микроскопии перед встраиванием
Summary
В этом протоколе подробно описаны этапы предварительной иммуноэлектронной микроскопии с акцентом на изучение синаптических цепей и локализации белков в сетчатке.
Abstract
Сетчатка состоит из многочисленных клеток, образующих различные нейронные цепи, которые составляют первую стадию зрительного пути. Каждая цепь характеризуется уникальными особенностями и различными нейротрансмиттерами, определяющими ее роль и функциональное значение. Учитывая сложность типов клеток в ее структуре, сложность нейронных цепей в сетчатке создает проблемы для исследования. Чтобы лучше исследовать цепи сетчатки и перекрестные помехи, такие как связь между колбочками и палочками, а также точную молекулярную локализацию (нейротрансмиттеры или нейропептиды), такую как наличие вещества Р-подобной иммунореактивности в сетчатке мыши, мы использовали метод иммуноэлектронной микроскопии (иммуно-ЭМ) для изучения синаптических связей и организации. Этот подход позволяет нам точно определить специфические межклеточные синаптические связи и точную молекулярную локализацию, а также может сыграть ведущую роль в изучении его функции. В этой статье описывается протокол, используемые реагенты и подробные шаги, включая (1) подготовку к фиксации сетчатки, (2) предварительное иммуноокрашивание и (3) постфиксацию и встраивание.
Introduction
Сложность нейронных цепей в сетчатке представляет трудности для исследования, учитывая разнообразие типов клеток в ее структуре 1,2. Начальный этап включает в себя выявление синаптических связей между различными клетками и определение клеточной локализации специфических нейротрансмиттеров или нейропептидов. По мере того, как молекулярная биология вводит новые белки, точная локализация в сетчатке становится решающей для понимания их функций и анализа цепей сетчатки и синаптических связей 3,4,5.
Из-за ограниченного разрешения световой микроскопии, электронная микроскопия (ЭМ) обычно используется для обнаружения субклеточных структур нервных клеток. ЭМ имеет различные классификации, при этом для наблюдения ультраструктур клеток используется обычная просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) 6,7,8,9. Иммуноэлектронная микроскопия (иммуно-ЭМ), сочетающая пространственное разрешение ЭМ с химической идентификацией антител, специфически связывающихся с белками10, выделяется как оптимальный и эксклюзивный метод исследования синаптических связей и локализации субклеточных белков в сетчатке 11,12.
Методы иммуно-ЭМ можно разделить на методы до встраивания и после встраивания в зависимости от порядка встраивания и инкубации антител. По сравнению с методом пост-эмбеддинга, подход с предварительным встраиванием способен проводить крупномасштабную и дальнюю идентификацию 13,14,15, предлагая оптимальный подход для изучения клеточных процессов, таких как аксоны и дендриты. Кроме того, этот метод обеспечивает сильный сигнал и широкое поле зрения, что делает его предпочтительным для всесторонних исследований экспрессии белка и молекулярной локализации в цитоплазме. Этот метод оказывается особенно ценным для обеспечения химически идентифицированных структур, видимых по всей цитоплазме, клеткам или сетчатке.
Тем не менее, метод после встраивания, хотя и имеет более низкую проникающую способность или диффузию по сравнению с методом предварительного встраивания, не так чувствителен16,17. Проще говоря, если целью является изучение локализации специфических нейротрансмиттеров в цитоплазме или синаптических окончаниях, предпочтительным методом является предварительное встраивание иммуно-ЭМ. И наоборот, для выявления локализации мембранных рецепторов более рекомендуется использовать поствстраивание иммуноголда ЭМ.
Учитывая эти соображения, мы выбираем метод предварительного встраивания иммуно-ЭМ для изучения цепей сетчатки, включая взаимодействие между колбочками и палочками, а также молекулярную локализацию, такую как распределение и синаптическая организация вещества P-подобной иммунореактивности (SP-IR) в сетчатке мыши.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье описаны три критических шага для успешного наблюдения синаптических цепей и локализации белка: (1) быстрая и слабая фиксация, (2) предварительное иммуноокрашивание и (3) постфиксация и встраивание.
Мы предполагаем, что фиксация является ключ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была частично поддержана грантами Национальной программы ключевых исследований и разработок Китая (2022YFA1105503), Государственной ключевой лаборатории нейронаук (SKLN-202103), Чжэцзянского фонда естественных наук Китая (Y21H120019).
Materials
| 1 mL syringe needle | kangdelai | ||
| 1% OsO4 | Electron Microscopy Science | 19100 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| 8% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Science | 16020 | |
| 8% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 157-8 | |
| Acetone | Electron Microscopy Science | 10000 | |
| Anti-rabbit PKC | Sigma-Aldrich | P4334 | |
| Anti-Rabbit SP | Abcam | ab67006 | |
| DAB Substrate kit | MXB Biotechnologies | KIT-9701/9702/9703 | |
| Elbow scissors | Suzhou66 vision company | 54010 | |
| Electron microscope | Phillips | CM120 | |
| Epon resin | Electron Microscopy Science | 14910 | |
| forcep | Suzhou66 vision company | S101A | |
| Millipore filter paper | Merck Millipore | PR05538 | |
| Na2HPO4· 12H2O | Sigma | 71650 | A component of phosphate buffer |
| NaH2PO4· H2O | Sigma | 71507 | A component of phosphate buffer |
| Picric acid | Electron Microscopy Science | 19550 | |
| Sodium borohydride (NaBH4) | Sigma | 215511 | |
| Tris | Solarbio | 917R071 | |
| Ultramicrotome | Leica | ||
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Science | 22400 | |
| VACTASTAIN ABC kit, Peroxidase (Rabbit IgG) | Vector Laboratories | PK-4001 |
References
- Chua, N. J., et al. A complete reconstruction of the early visual system of an adult insect. Curr Biol. 33 (21), 4611-4623.e4614 (2023).
- Ravi Chander, P., Hanson, L., Chundekkad, L., Awatramani, G. B. Neural circuits underlying multi-feature extraction in the retina. J Neurosci. , (2023).
- Sirivisoot, S., et al. Development and characterization of mouse anti-canine PD-L1 monoclonal antibodies and their expression in canine tumors by immunohistochemistry in vitro. Vet Q. 43 (1), 1-9 (2023).
- Raeisi, H., et al. Development and characterization of phage display-derived anti-toxin antibodies neutralizing TcdA and TcdB of Clostridioides difficile. Microbiol Spectr. 11 (5), e0531022 (2023).
- Ryschich, A., Dong, Y., Schäfer, M., Ryschich, E., Karakhanova, S. DWH24: A new antibody for fluorescence-based cell death analysis. Methods Appl Fluoresc. 11 (4), (2023).
- Jastrzebska, B., et al. Functional characterization of rhodopsin monomers and dimers in detergents. J Biol Chem. 279 (52), 54663-54675 (2004).
- Huang, P., et al. Mechanism of Shenfu injection in suppressing inflammation and preventing sepsis-induced apoptosis in murine cardiomyocytes based on network pharmacology and experimental validation. J Ethnopharmacol. 322, 117599 (2024).
- Maheshwari, U., et al. Inorganic phosphate exporter heterozygosity in mice leads to brain vascular calcification, microangiopathy, and microgliosis. Brain Pathol. 33 (6), e13189 (2023).
- Mackiewicz, J., et al. Effect of gravity in long-term vitreous tamponade: In vivo investigation using perfluorocarbon liquids and semi-fluorinated alkanes. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 245 (5), 665-675 (2007).
- Luján, R., Rubio, M. E. Editorial: Immunoelectron microscopy: Placing molecular functions within a neuronal context. Front Neuroanat. 16, 1043371 (2022).
- Xu, S., et al. Synaptic changes and the response of microglia in a light-induced photoreceptor degeneration model. Mol Vis. 27, 206-220 (2021).
- Chadha, A., Volland, S., Baliaouri, N. V., Tran, E. M., Williams, D. S. The route of the visual receptor rhodopsin along the cilium. J Cell Sci. 132 (10), jcs.229526 (2019).
- Huang, H. J., et al. Multiple nucleocapsid structural forms of shrimp white spot syndrome virus suggests a novel viral morphogenetic pathway. Int J Mol Sci. 24 (8), 7525 (2023).
- Tissarinen, P., et al. Elevated human placental heat shock protein 5 is associated with spontaneous preterm birth. Pediatr Res. 94 (2), 520-529 (2023).
- Huang, Z., et al. A neural tract tracing study on synaptic connections for cortical glutamatergic terminals and cervical spinal calretinin neurons in rats. Front Neural Circuits. 17, 1086873 (2023).
- Zhang, J., Petralia, R. S., Wang, Y. X., Diamond, J. S. High-resolution quantitative immunogold analysis of membrane receptors at retinal ribbon synapses. J Vis Exp. 108, e53547 (2016).
- Ottersen, O. P., Landsend, A. S. Organization of glutamate receptors at the synapse. Eur J Neurosci. 9 (11), 2219-2224 (1997).
- Greferath, U., Grünert, U., Wässle, H. Rod bipolar cells in the mammalian retina show protein kinase C-like immunoreactivity. J Comp Neurol. 301 (3), 433-442 (1990).
- Wang, F., et al. Distribution and synaptic organization of substance P-like immunoreactive neurons in the mouse retina. Brain Struct Funct. 228 (7), 1703-1724 (2023).
- van Opbergen, C. J. M., et al. 34;Orphan" Connexin43 in Plakophilin-2 deficient hearts revealed by volume electron microscopy. Front Cell Dev Biol. 10, 843687 (2022).
- Li, S., et al. Safe and efficient oral allergy immunotherapy using one-pot-prepared mannan-coated allergen nanoparticles. Biomaterials. 303, 122381 (2023).
- Yamashita, K., Kusakabe, M., Sano, M. A simple and rapid method of dissociating hepatocytes from fixed liver of the mouse. Stain Technol. 56 (1), 29-33 (1981).
- Tanabe, T., Shin, M., Fujiwara, K. Immunoelectron microscopy study of polyamines using a newly prepared monoclonal antibody against spermidine: use of a mixture of glutaraldehyde and paraformaldehyde as a cross-linking agent in the preparation of the antigen. J Biochem. 135 (4), 501-507 (2004).
- Xiao, J., et al. Rod bipolar cells receive cone photoreceptor inputs through both invaginating synapses and flat contacts in the mouse and guinea pig retinas. J Comp Neurol. 531 (11), 1184-1197 (2023).
- Yang, Q., et al. Expression of α-Synuclein in the mouse retina is confined to inhibitory presynaptic elements. J Comp Neurol. 531 (10), 1057-1079 (2023).
- Yazulla, S., Studholme, K. M., Zucker, C. L. Synaptic organization of substance P-like immunoreactive amacrine cells in goldfish retina. J Comp Neurol. 231 (2), 232-238 (1985).
- Sassoè-Pognetto, M., Wässle, H., Grünert, U. Glycinergic synapses in the rod pathway of the rat retina: cone bipolar cells express the alpha 1 subunit of the glycine receptor. J Neurosci. 14 (8), 5131-5146 (1994).
- Hartveit, E., et al. Localization and developmental expression of the NMDA receptor subunit NR2A in the mammalian retina. J Comp Neurol. 348 (4), 570-582 (1994).
- Perkins, G. A. The use of miniSOG in the localization of mitochondrial proteins. Methods Enzymol. 547, 165-179 (2014).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS Biol. 9 (4), e1001041 (2011).
- Kar, D., et al. Volume electron microscopy reveals human retinal mitochondria that align with reflective bands in optical coherence tomography [Invited]. Biomed Opt Express. 14 (10), 5512-5527 (2023).
- Johnson, J. E., et al. Spatiotemporal regulation of ATP and Ca2+ dynamics in vertebrate rod and cone ribbon synapses. Mol Vis. 13, 887-919 (2007).
