Este protocolo descreve as etapas detalhadas da microscopia imunoeletrônica pré-incorporada, com foco na exploração de circuitos sinápticos e localização de proteínas na retina.
A retina compreende numerosas células que formam diversos circuitos neuronais, que constituem o primeiro estágio da via visual. Cada circuito é caracterizado por características únicas e neurotransmissores distintos, determinando seu papel e significado funcional. Dados os intrincados tipos de células dentro de sua estrutura, a complexidade dos circuitos neuronais na retina apresenta desafios para a exploração. Para investigar melhor os circuitos retinianos e a conversa cruzada, como a ligação entre as vias do cone e do bastonete, e a localização molecular precisa (neurotransmissores ou neuropeptídeos), como a presença de imunorreatividade semelhante à substância P na retina do camundongo, empregamos um método de microscopia imunoeletrônica pré-incorporada (imuno-EM) para explorar as conexões sinápticas e a organização. Essa abordagem nos permite identificar conexões sinápticas intercelulares específicas e localização molecular precisa e pode desempenhar um papel orientador na exploração de sua função. Este artigo descreve o protocolo, os reagentes usados e as etapas detalhadas, incluindo (1) preparação para fixação da retina, (2) imunocoloração pré-incorporação e (3) pós-fixação e incorporação.
A complexidade dos circuitos neuronais na retina apresenta desafios para exploração, considerando os diversos tipos de células dentro de sua estrutura 1,2. A etapa inicial envolve a identificação de conexões sinápticas entre diferentes células e a determinação da localização celular de neurotransmissores ou neuropeptídeos específicos. À medida que os avanços da biologia molecular introduzem novas proteínas, a localização precisa na retina torna-se crucial para entender suas funções e analisar os circuitos retinianos e as conexões sinápticas 3,4,5.
Devido à resolução limitada da microscopia de luz, a microscopia eletrônica (EM) é comumente usada para detectar as estruturas subcelulares das células nervosas. O EM possui várias classificações, sendo a microscopia eletrônica de transmissão convencional (TEM) utilizada para observar as ultraestruturas celulares 6,7,8,9. A microscopia imunoeletrônica (immuno-EM), que combina a resolução espacial do EM com a capacidade de identificação química de anticorpos que se ligam especificamente às proteínas10, destaca-se como o método ideal e exclusivo para investigar conexões sinápticas e localização de proteínas subcelulares na retina11,12.
As técnicas de imuno-EM podem ser divididas em métodos de pré-incorporação e pós-incorporação com base na ordem de incorporação e incubação de anticorpos. Em comparação com o método pós-incorporação, a abordagem pré-incorporação é capaz de identificação em larga escala e longa distância13 , 14 , 15 , oferecendo uma abordagem ideal para estudar processos celulares como axônios e dendritos. Além disso, essa técnica fornece um sinal forte e amplo campo de visão, tornando-a vantajosa para investigações abrangentes da expressão de proteínas e localização molecular no citoplasma. Este método é particularmente valioso para garantir estruturas quimicamente identificadas que são visíveis em todo o citoplasma, células ou retina.
No entanto, o método pós-embedding, embora tenha menor penetração ou difusão em comparação com o método pré-embedding, não é tão sensível16,17. Em termos simples, se o objetivo é explorar a localização de neurotransmissores específicos no citoplasma ou nos terminais sinápticos, o imuno-EM pré-incorporado é o método preferido. Por outro lado, para identificar a localização dos receptores de membrana, é mais recomendável utilizar o imunogold EM pós-incorporação.
Dadas essas considerações, optamos pelo método imuno-EM pré-incorporação para mergulhar nos circuitos da retina, incluindo a interação entre as vias do cone e do bastonete, e a localização molecular, como a distribuição e organização sináptica da imunorreatividade semelhante à substância P (SP-IR) na retina do camundongo.
Este artigo descreveu três etapas críticas para a observação bem-sucedida dos circuitos sinápticos e localização de proteínas: (1) fixação rápida e fraca, (2) imunocoloração pré-incorporação e (3) pós-fixação e incorporação.
Propomos que a fixação é o passo chave para uma abordagem imuno-EM pré-incorporação bem-sucedida. Assim, a importância do fixador fresco e da fixação rápida é enfatizada aqui, nomeando esse princípio de “pr…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado em parte por doações do Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China (2022YFA1105503), do Laboratório Estadual de Neurociência (SKLN-202103), da Fundação de Ciências Naturais de Zhejiang da China (Y21H120019).
1 mL syringe needle | kangdelai | ||
1% OsO4 | Electron Microscopy Science | 19100 | |
2,2,2-Tribromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
8% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Science | 16020 | |
8% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 157-8 | |
Acetone | Electron Microscopy Science | 10000 | |
Anti-rabbit PKC | Sigma-Aldrich | P4334 | |
Anti-Rabbit SP | Abcam | ab67006 | |
DAB Substrate kit | MXB Biotechnologies | KIT-9701/9702/9703 | |
Elbow scissors | Suzhou66 vision company | 54010 | |
Electron microscope | Phillips | CM120 | |
Epon resin | Electron Microscopy Science | 14910 | |
forcep | Suzhou66 vision company | S101A | |
Millipore filter paper | Merck Millipore | PR05538 | |
Na2HPO4· 12H2O | Sigma | 71650 | A component of phosphate buffer |
NaH2PO4· H2O | Sigma | 71507 | A component of phosphate buffer |
Picric acid | Electron Microscopy Science | 19550 | |
Sodium borohydride (NaBH4) | Sigma | 215511 | |
Tris | Solarbio | 917R071 | |
Ultramicrotome | Leica | ||
Uranyl acetate | Electron Microscopy Science | 22400 | |
VACTASTAIN ABC kit, Peroxidase (Rabbit IgG) | Vector Laboratories | PK-4001 |