Summary

Investigando circuitos retinianos e localização molecular por microscopia imunoeletrônica pré-incorporada

Published: July 12, 2024
doi:

Summary

Este protocolo descreve as etapas detalhadas da microscopia imunoeletrônica pré-incorporada, com foco na exploração de circuitos sinápticos e localização de proteínas na retina.

Abstract

A retina compreende numerosas células que formam diversos circuitos neuronais, que constituem o primeiro estágio da via visual. Cada circuito é caracterizado por características únicas e neurotransmissores distintos, determinando seu papel e significado funcional. Dados os intrincados tipos de células dentro de sua estrutura, a complexidade dos circuitos neuronais na retina apresenta desafios para a exploração. Para investigar melhor os circuitos retinianos e a conversa cruzada, como a ligação entre as vias do cone e do bastonete, e a localização molecular precisa (neurotransmissores ou neuropeptídeos), como a presença de imunorreatividade semelhante à substância P na retina do camundongo, empregamos um método de microscopia imunoeletrônica pré-incorporada (imuno-EM) para explorar as conexões sinápticas e a organização. Essa abordagem nos permite identificar conexões sinápticas intercelulares específicas e localização molecular precisa e pode desempenhar um papel orientador na exploração de sua função. Este artigo descreve o protocolo, os reagentes usados e as etapas detalhadas, incluindo (1) preparação para fixação da retina, (2) imunocoloração pré-incorporação e (3) pós-fixação e incorporação.

Introduction

A complexidade dos circuitos neuronais na retina apresenta desafios para exploração, considerando os diversos tipos de células dentro de sua estrutura 1,2. A etapa inicial envolve a identificação de conexões sinápticas entre diferentes células e a determinação da localização celular de neurotransmissores ou neuropeptídeos específicos. À medida que os avanços da biologia molecular introduzem novas proteínas, a localização precisa na retina torna-se crucial para entender suas funções e analisar os circuitos retinianos e as conexões sinápticas 3,4,5.

Devido à resolução limitada da microscopia de luz, a microscopia eletrônica (EM) é comumente usada para detectar as estruturas subcelulares das células nervosas. O EM possui várias classificações, sendo a microscopia eletrônica de transmissão convencional (TEM) utilizada para observar as ultraestruturas celulares 6,7,8,9. A microscopia imunoeletrônica (immuno-EM), que combina a resolução espacial do EM com a capacidade de identificação química de anticorpos que se ligam especificamente às proteínas10, destaca-se como o método ideal e exclusivo para investigar conexões sinápticas e localização de proteínas subcelulares na retina11,12.

As técnicas de imuno-EM podem ser divididas em métodos de pré-incorporação e pós-incorporação com base na ordem de incorporação e incubação de anticorpos. Em comparação com o método pós-incorporação, a abordagem pré-incorporação é capaz de identificação em larga escala e longa distância13 , 14 , 15 , oferecendo uma abordagem ideal para estudar processos celulares como axônios e dendritos. Além disso, essa técnica fornece um sinal forte e amplo campo de visão, tornando-a vantajosa para investigações abrangentes da expressão de proteínas e localização molecular no citoplasma. Este método é particularmente valioso para garantir estruturas quimicamente identificadas que são visíveis em todo o citoplasma, células ou retina.

No entanto, o método pós-embedding, embora tenha menor penetração ou difusão em comparação com o método pré-embedding, não é tão sensível16,17. Em termos simples, se o objetivo é explorar a localização de neurotransmissores específicos no citoplasma ou nos terminais sinápticos, o imuno-EM pré-incorporado é o método preferido. Por outro lado, para identificar a localização dos receptores de membrana, é mais recomendável utilizar o imunogold EM pós-incorporação.

Dadas essas considerações, optamos pelo método imuno-EM pré-incorporação para mergulhar nos circuitos da retina, incluindo a interação entre as vias do cone e do bastonete, e a localização molecular, como a distribuição e organização sináptica da imunorreatividade semelhante à substância P (SP-IR) na retina do camundongo.

Protocol

O cuidado e o manuseio dos animais foram aprovados pelo Regulamento do Comitê de Ética da Universidade Médica de Wenzhou, de acordo com as diretrizes da ARVO. Camundongos adultos (C57BL/6J, machos e fêmeas, 8 a 12 semanas de idade) foram utilizados nesta pesquisa. O equipamento e os reagentes necessários para o estudo estão listados na Tabela de Materiais. 1. Preparação para fixação da retina Monte os segui…

Representative Results

A Figura 1 mostra exemplos de experimentos de controle sem a incubação de anticorpos primários contra a proteína quinase C alfa (PKCα) ou SP, nos quais nenhuma imunorreatividade (IR) foi encontrada. A Figura 2 mostra o PKCα-IR na retina do camundongo. PKCα serve como um marcador para todas as células bipolares de bastonetes (RBC) na retina18. No nível de microscopia el…

Discussion

Este artigo descreveu três etapas críticas para a observação bem-sucedida dos circuitos sinápticos e localização de proteínas: (1) fixação rápida e fraca, (2) imunocoloração pré-incorporação e (3) pós-fixação e incorporação.

Propomos que a fixação é o passo chave para uma abordagem imuno-EM pré-incorporação bem-sucedida. Assim, a importância do fixador fresco e da fixação rápida é enfatizada aqui, nomeando esse princípio de “pr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado em parte por doações do Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China (2022YFA1105503), do Laboratório Estadual de Neurociência (SKLN-202103), da Fundação de Ciências Naturais de Zhejiang da China (Y21H120019).

Materials

1 mL syringe needle kangdelai
1% OsO4 Electron Microscopy Science 19100
2,2,2-Tribromoethanol Sigma-Aldrich T48402
8% Glutaraldehyde Electron Microscopy Science 16020
8% Paraformaldehyde Electron Microscopy Science 157-8
Acetone Electron Microscopy Science 10000
Anti-rabbit PKC Sigma-Aldrich P4334
Anti-Rabbit SP Abcam ab67006
DAB Substrate kit MXB Biotechnologies KIT-9701/9702/9703
Elbow scissors Suzhou66 vision company 54010
Electron microscope Phillips CM120
Epon resin Electron Microscopy Science 14910
forcep Suzhou66 vision company S101A
Millipore filter paper Merck Millipore  PR05538
Na2HPO4· 12H2O Sigma 71650 A component of phosphate buffer
NaH2PO4· H2O Sigma 71507 A component of phosphate buffer
Picric acid Electron Microscopy Science 19550
Sodium borohydride (NaBH4)  Sigma 215511
Tris Solarbio 917R071
Ultramicrotome Leica
Uranyl acetate Electron Microscopy Science 22400
VACTASTAIN ABC kit, Peroxidase (Rabbit IgG) Vector Laboratories PK-4001

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Cite This Article
Wang, F., Zhong, W., Zhang, J. Investigating Retinal Circuits and Molecular Localization by Pre-Embedding Immunoelectron Microscopy. J. Vis. Exp. (209), e66543, doi:10.3791/66543 (2024).

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