فحص دوائر الشبكية والتوطين الجزيئي عن طريق التضمين المسبق للمجهر الإلكتروني المناعي
Summary
يحدد هذا البروتوكول الخطوات التفصيلية للفحص المجهري الإلكتروني المناعي قبل التضمين ، مع التركيز على استكشاف الدوائر المشبكية وتوطين البروتين في شبكية العين.
Abstract
تتكون شبكية العين من العديد من الخلايا التي تشكل دوائر عصبية متنوعة ، والتي تشكل المرحلة الأولى من المسار البصري. تتميز كل دائرة بميزات فريدة وناقلات عصبية متميزة ، تحدد دورها وأهميتها الوظيفية. بالنظر إلى أنواع الخلايا المعقدة داخل هيكلها ، فإن تعقيد الدوائر العصبية في شبكية العين يشكل تحديات للاستكشاف. للتحقيق بشكل أفضل في دوائر الشبكية والحديث المتبادل ، مثل الرابط بين المسارات المخروطية والقضيب ، والتوطين الجزيئي الدقيق (الناقلات العصبية أو الببتيدات العصبية) ، مثل وجود تفاعل مناعي يشبه المادة P في شبكية العين على الفأر ، استخدمنا طريقة المجهر الإلكتروني المناعي قبل التضمين (immuno-EM) لاستكشاف الروابط المشبكية والتنظيم. يمكننا هذا النهج من تحديد اتصالات متشابكة محددة بين الخلايا وتحديد الموقع الجزيئي الدقيق ويمكن أن يلعب دورا توجيهيا في استكشاف وظيفته. توضح هذه المقالة البروتوكول والكواشف المستخدمة والخطوات التفصيلية ، بما في ذلك (1) إعداد تثبيت شبكية العين ، (2) التضمين المسبق للمناعة ، و (3) التثبيت والتضمين اللاحق.
Introduction
يمثل تعقيد الدوائر العصبية في شبكية العين تحديات للاستكشاف ، مع الأخذ في الاعتبار أنواع الخلايا المتنوعة داخل هيكلها 1,2. تتضمن الخطوة الأولى تحديد الروابط المشبكية بين الخلايا المختلفة وتحديد التوطين الخلوي لناقلات عصبية معينة أو ببتيدات عصبية. مع تقدم البيولوجيا الجزيئية لإدخال بروتينات جديدة ، يصبح التوطين الدقيق في شبكية العين أمرا بالغ الأهمية لفهم وظائفها وتحليل دوائر الشبكية والوصلات المشبكية3،4،5.
نظرا للدقة المحدودة للفحص المجهري الضوئي ، يستخدم المجهر الإلكتروني (EM) بشكل شائع للكشف عن الهياكل تحت الخلوية للخلايا العصبية. يحتوي EM على تصنيفات مختلفة ، مع استخدام المجهر الإلكتروني التقليدي (TEM) لمراقبة الهياكل الفائقة للخلايا6،7،8،9. المجهر الإلكتروني المناعي (immuno-EM) ، الذي يجمع بين الدقة المكانية ل EM مع القدرة على التعرف الكيميائي للأجسام المضادة المرتبطة على وجه التحديد بالبروتينات10 ، يبرز كطريقة مثالية وحصرية للتحقيق في الاتصالات المشبكية وتوطين البروتين تحت الخلوي في شبكية العين11,12.
يمكن تقسيم تقنيات EM المناعية إلى طرق ما قبل التضمين وما بعد التضمين بناء على ترتيب التضمين وحضانة الأجسام المضادة. بالمقارنة مع طريقة ما بعد التضمين ، فإن نهج ما قبل التضمين قادر على تحديد13،14،15 على نطاق واسع وبعيد المدى ، مما يوفر نهجا مثاليا لدراسة عمليات الخلايا مثل المحاور العصبية والتشعبات. بالإضافة إلى ذلك ، توفر هذه التقنية إشارة قوية ومجال رؤية واسع ، مما يجعلها مفيدة للتحقيقات الشاملة للتعبير البروتيني والتوطين الجزيئي في السيتوبلازم. تثبت هذه الطريقة قيمتها بشكل خاص في ضمان الهياكل المحددة كيميائيا والتي تكون مرئية في جميع أنحاء السيتوبلازم أو الخلايا أو شبكية العين بأكملها.
ومع ذلك ، فإن طريقة ما بعد التضمين ، على الرغم من انخفاض الاختراق أو الانتشار مقارنة بطريقة التضمين المسبق ، ليست حساسة16,17. بعبارات بسيطة ، إذا كان الهدف هو استكشاف توطين ناقلات عصبية معينة في السيتوبلازم أو المحطات المشبكية ، فإن التضمين المسبق المناعي EM هو الطريقة المفضلة. على العكس من ذلك ، لتحديد توطين مستقبلات الغشاء ، يوصى باستخدام EM المناعي بعد التضمين.
بالنظر إلى هذه الاعتبارات ، نختار طريقة التضمين المسبق المناعي الكهرومغناطيسي للتعمق في دوائر الشبكية ، بما في ذلك التفاعل بين المسارات المخروطية والقضيب ، والتوطين الجزيئي ، مثل التوزيع والتنظيم المشبكي للمادة P-LIKE IMMUNOACTIVITY (SP-IR) في شبكية الفأر.
Protocol
Representative Results
Discussion
وصفت هذه المقالة ثلاث خطوات حاسمة للمراقبة الناجحة للدوائر المشبكية وتوطين البروتين: (1) التثبيت السريع والضعيف ، (2) التضمين المسبق للمناعة ، و (3) التثبيت والتضمين اللاحق.
نقترح أن التثبيت هو الخطوة الأساسية لنهج EM المناعي المقبول الناجح. وبالتالي ، يتم ال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال منح من البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2022YFA1105503) ، ومختبر الدولة الرئيسي لعلم الأعصاب (SKLN-202103) ، ومؤسسة تشجيانغ للعلوم الطبيعية في الصين (Y21H120019).
Materials
| 1 mL syringe needle | kangdelai | ||
| 1% OsO4 | Electron Microscopy Science | 19100 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| 8% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Science | 16020 | |
| 8% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 157-8 | |
| Acetone | Electron Microscopy Science | 10000 | |
| Anti-rabbit PKC | Sigma-Aldrich | P4334 | |
| Anti-Rabbit SP | Abcam | ab67006 | |
| DAB Substrate kit | MXB Biotechnologies | KIT-9701/9702/9703 | |
| Elbow scissors | Suzhou66 vision company | 54010 | |
| Electron microscope | Phillips | CM120 | |
| Epon resin | Electron Microscopy Science | 14910 | |
| forcep | Suzhou66 vision company | S101A | |
| Millipore filter paper | Merck Millipore | PR05538 | |
| Na2HPO4· 12H2O | Sigma | 71650 | A component of phosphate buffer |
| NaH2PO4· H2O | Sigma | 71507 | A component of phosphate buffer |
| Picric acid | Electron Microscopy Science | 19550 | |
| Sodium borohydride (NaBH4) | Sigma | 215511 | |
| Tris | Solarbio | 917R071 | |
| Ultramicrotome | Leica | ||
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Science | 22400 | |
| VACTASTAIN ABC kit, Peroxidase (Rabbit IgG) | Vector Laboratories | PK-4001 |
References
- Chua, N. J., et al. A complete reconstruction of the early visual system of an adult insect. Curr Biol. 33 (21), 4611-4623.e4614 (2023).
- Ravi Chander, P., Hanson, L., Chundekkad, L., Awatramani, G. B. Neural circuits underlying multi-feature extraction in the retina. J Neurosci. , (2023).
- Sirivisoot, S., et al. Development and characterization of mouse anti-canine PD-L1 monoclonal antibodies and their expression in canine tumors by immunohistochemistry in vitro. Vet Q. 43 (1), 1-9 (2023).
- Raeisi, H., et al. Development and characterization of phage display-derived anti-toxin antibodies neutralizing TcdA and TcdB of Clostridioides difficile. Microbiol Spectr. 11 (5), e0531022 (2023).
- Ryschich, A., Dong, Y., Schäfer, M., Ryschich, E., Karakhanova, S. DWH24: A new antibody for fluorescence-based cell death analysis. Methods Appl Fluoresc. 11 (4), (2023).
- Jastrzebska, B., et al. Functional characterization of rhodopsin monomers and dimers in detergents. J Biol Chem. 279 (52), 54663-54675 (2004).
- Huang, P., et al. Mechanism of Shenfu injection in suppressing inflammation and preventing sepsis-induced apoptosis in murine cardiomyocytes based on network pharmacology and experimental validation. J Ethnopharmacol. 322, 117599 (2024).
- Maheshwari, U., et al. Inorganic phosphate exporter heterozygosity in mice leads to brain vascular calcification, microangiopathy, and microgliosis. Brain Pathol. 33 (6), e13189 (2023).
- Mackiewicz, J., et al. Effect of gravity in long-term vitreous tamponade: In vivo investigation using perfluorocarbon liquids and semi-fluorinated alkanes. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 245 (5), 665-675 (2007).
- Luján, R., Rubio, M. E. Editorial: Immunoelectron microscopy: Placing molecular functions within a neuronal context. Front Neuroanat. 16, 1043371 (2022).
- Xu, S., et al. Synaptic changes and the response of microglia in a light-induced photoreceptor degeneration model. Mol Vis. 27, 206-220 (2021).
- Chadha, A., Volland, S., Baliaouri, N. V., Tran, E. M., Williams, D. S. The route of the visual receptor rhodopsin along the cilium. J Cell Sci. 132 (10), jcs.229526 (2019).
- Huang, H. J., et al. Multiple nucleocapsid structural forms of shrimp white spot syndrome virus suggests a novel viral morphogenetic pathway. Int J Mol Sci. 24 (8), 7525 (2023).
- Tissarinen, P., et al. Elevated human placental heat shock protein 5 is associated with spontaneous preterm birth. Pediatr Res. 94 (2), 520-529 (2023).
- Huang, Z., et al. A neural tract tracing study on synaptic connections for cortical glutamatergic terminals and cervical spinal calretinin neurons in rats. Front Neural Circuits. 17, 1086873 (2023).
- Zhang, J., Petralia, R. S., Wang, Y. X., Diamond, J. S. High-resolution quantitative immunogold analysis of membrane receptors at retinal ribbon synapses. J Vis Exp. 108, e53547 (2016).
- Ottersen, O. P., Landsend, A. S. Organization of glutamate receptors at the synapse. Eur J Neurosci. 9 (11), 2219-2224 (1997).
- Greferath, U., Grünert, U., Wässle, H. Rod bipolar cells in the mammalian retina show protein kinase C-like immunoreactivity. J Comp Neurol. 301 (3), 433-442 (1990).
- Wang, F., et al. Distribution and synaptic organization of substance P-like immunoreactive neurons in the mouse retina. Brain Struct Funct. 228 (7), 1703-1724 (2023).
- van Opbergen, C. J. M., et al. 34;Orphan" Connexin43 in Plakophilin-2 deficient hearts revealed by volume electron microscopy. Front Cell Dev Biol. 10, 843687 (2022).
- Li, S., et al. Safe and efficient oral allergy immunotherapy using one-pot-prepared mannan-coated allergen nanoparticles. Biomaterials. 303, 122381 (2023).
- Yamashita, K., Kusakabe, M., Sano, M. A simple and rapid method of dissociating hepatocytes from fixed liver of the mouse. Stain Technol. 56 (1), 29-33 (1981).
- Tanabe, T., Shin, M., Fujiwara, K. Immunoelectron microscopy study of polyamines using a newly prepared monoclonal antibody against spermidine: use of a mixture of glutaraldehyde and paraformaldehyde as a cross-linking agent in the preparation of the antigen. J Biochem. 135 (4), 501-507 (2004).
- Xiao, J., et al. Rod bipolar cells receive cone photoreceptor inputs through both invaginating synapses and flat contacts in the mouse and guinea pig retinas. J Comp Neurol. 531 (11), 1184-1197 (2023).
- Yang, Q., et al. Expression of α-Synuclein in the mouse retina is confined to inhibitory presynaptic elements. J Comp Neurol. 531 (10), 1057-1079 (2023).
- Yazulla, S., Studholme, K. M., Zucker, C. L. Synaptic organization of substance P-like immunoreactive amacrine cells in goldfish retina. J Comp Neurol. 231 (2), 232-238 (1985).
- Sassoè-Pognetto, M., Wässle, H., Grünert, U. Glycinergic synapses in the rod pathway of the rat retina: cone bipolar cells express the alpha 1 subunit of the glycine receptor. J Neurosci. 14 (8), 5131-5146 (1994).
- Hartveit, E., et al. Localization and developmental expression of the NMDA receptor subunit NR2A in the mammalian retina. J Comp Neurol. 348 (4), 570-582 (1994).
- Perkins, G. A. The use of miniSOG in the localization of mitochondrial proteins. Methods Enzymol. 547, 165-179 (2014).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS Biol. 9 (4), e1001041 (2011).
- Kar, D., et al. Volume electron microscopy reveals human retinal mitochondria that align with reflective bands in optical coherence tomography [Invited]. Biomed Opt Express. 14 (10), 5512-5527 (2023).
- Johnson, J. E., et al. Spatiotemporal regulation of ATP and Ca2+ dynamics in vertebrate rod and cone ribbon synapses. Mol Vis. 13, 887-919 (2007).
