Étude des circuits rétiniens et de la localisation moléculaire par immunomicroscopie électronique pré-intégrée
Summary
Ce protocole décrit en détail les étapes de la pré-intégration de l’immunomicroscopie électronique, en mettant l’accent sur l’exploration des circuits synaptiques et la localisation des protéines dans la rétine.
Abstract
La rétine comprend de nombreuses cellules formant divers circuits neuronaux, qui constituent la première étape de la voie visuelle. Chaque circuit est caractérisé par des caractéristiques uniques et des neurotransmetteurs distincts, déterminant son rôle et sa signification fonctionnelle. Étant donné la complexité des types de cellules au sein de sa structure, la complexité des circuits neuronaux de la rétine pose des défis pour l’exploration. Pour mieux étudier les circuits rétiniens et la diaphonie, tels que le lien entre les voies du cône et du bâtonnet, et la localisation moléculaire précise (neurotransmetteurs ou neuropeptides), comme la présence d’une immunoréactivité de type P dans la rétine de la souris, nous avons utilisé une méthode d’immunomicroscopie électronique pré-intégrée (immuno-EM) pour explorer les connexions synaptiques et l’organisation. Cette approche nous permet d’identifier des connexions synaptiques intercellulaires spécifiques et une localisation moléculaire précise et pourrait jouer un rôle guide dans l’exploration de sa fonction. Cet article décrit le protocole, les réactifs utilisés et les étapes détaillées, y compris (1) la préparation de la fixation de la rétine, (2) l’immunocoloration avant l’intégration et (3) la post-fixation et l’intégration.
Introduction
La complexité des circuits neuronaux de la rétine présente des défis pour l’exploration, compte tenu de la diversité des types de cellules au sein de sa structure 1,2. La première étape consiste à identifier les connexions synaptiques entre différentes cellules et à déterminer la localisation cellulaire de neurotransmetteurs ou neuropeptides spécifiques. À mesure que les progrès de la biologie moléculaire introduisent de nouvelles protéines, une localisation précise dans la rétine devient cruciale pour comprendre leurs fonctions et analyser les circuits rétiniens et les connexions synaptiques 3,4,5.
En raison de la résolution limitée de la microscopie optique, la microscopie électronique (EM) est couramment utilisée pour détecter les structures subcellulaires des cellules nerveuses. EM a différentes classifications, la microscopie électronique à transmission conventionnelle (MET) étant utilisée pour l’observation des ultrastructurescellulaires 6,7,8,9. L’immunomicroscopie électronique (immuno-EM), qui combine la résolution spatiale des EM avec la capacité d’identification chimique des anticorps se liant spécifiquement aux protéines10, se distingue comme la méthode optimale et exclusive pour étudier les connexions synaptiques et la localisation des protéines subcellulaires dans la rétine11,12.
Les techniques d’immuno-EM peuvent être divisées en méthodes de pré-intégration et de post-intégration en fonction de l’ordre d’intégration et d’incubation des anticorps. Par rapport à la méthode de post-intégration, l’approche de pré-intégration est capable d’une identification à grande échelle et à longue distance 13,14,15, offrant une approche optimale pour l’étude des processus cellulaires tels que les axones et les dendrites. De plus, cette technique fournit un signal fort et un large champ de vision, ce qui la rend avantageuse pour des études complètes de l’expression des protéines et de la localisation moléculaire dans le cytoplasme. Cette méthode s’avère particulièrement précieuse pour garantir des structures chimiquement identifiées qui sont visibles dans l’ensemble du cytoplasme, des cellules ou de la rétine.
Cependant, la méthode de post-intégration, bien qu’ayant une pénétration ou une diffusion plus faible par rapport à la méthode de pré-intégration, n’est pas aussi sensible16,17. En termes simples, si l’objectif est d’explorer la localisation de neurotransmetteurs spécifiques dans le cytoplasme ou les terminaisons synaptiques, l’immuno-EM de pré-intégration est la méthode privilégiée. À l’inverse, pour identifier la localisation des récepteurs membranaires, il est plus recommandé d’utiliser l’immunogold EM post-intégration.
Compte tenu de ces considérations, nous optons pour la méthode immuno-EM de pré-intégration pour approfondir les circuits rétiniens, y compris l’interaction entre les voies du cône et du bâtonnet, et la localisation moléculaire, telle que la distribution et l’organisation synaptique de l’immunoréactivité de type P (SP-IR) dans la rétine de la souris.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article a décrit trois étapes critiques pour l’observation réussie des circuits synaptiques et de la localisation des protéines : (1) la fixation rapide et faible, (2) l’immunomarquage avant l’intégration et (3) la post-fixation et l’intégration.
Nous proposons que la fixation soit l’étape clé d’une approche immuno-EM réussie de pré-intégration. Ainsi, l’importance d’un fixateur frais et d’une fixation rapide est soulignée ici…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu en partie par des subventions du Programme national de recherche et de développement clés de Chine (2022YFA1105503), du Laboratoire d’État clé de neurosciences (SKLN-202103) de la Fondation des sciences naturelles du Zhejiang de Chine (Y21H120019).
Materials
| 1 mL syringe needle | kangdelai | ||
| 1% OsO4 | Electron Microscopy Science | 19100 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| 8% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Science | 16020 | |
| 8% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 157-8 | |
| Acetone | Electron Microscopy Science | 10000 | |
| Anti-rabbit PKC | Sigma-Aldrich | P4334 | |
| Anti-Rabbit SP | Abcam | ab67006 | |
| DAB Substrate kit | MXB Biotechnologies | KIT-9701/9702/9703 | |
| Elbow scissors | Suzhou66 vision company | 54010 | |
| Electron microscope | Phillips | CM120 | |
| Epon resin | Electron Microscopy Science | 14910 | |
| forcep | Suzhou66 vision company | S101A | |
| Millipore filter paper | Merck Millipore | PR05538 | |
| Na2HPO4· 12H2O | Sigma | 71650 | A component of phosphate buffer |
| NaH2PO4· H2O | Sigma | 71507 | A component of phosphate buffer |
| Picric acid | Electron Microscopy Science | 19550 | |
| Sodium borohydride (NaBH4) | Sigma | 215511 | |
| Tris | Solarbio | 917R071 | |
| Ultramicrotome | Leica | ||
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Science | 22400 | |
| VACTASTAIN ABC kit, Peroxidase (Rabbit IgG) | Vector Laboratories | PK-4001 |
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