Studio dei circuiti retinici e della localizzazione molecolare mediante microscopia immunoelettronica pre-incorporata
Summary
Questo protocollo delinea le fasi dettagliate della microscopia immunoelettronica pre-incorporamento, con particolare attenzione all’esplorazione dei circuiti sinaptici e della localizzazione delle proteine nella retina.
Abstract
La retina comprende numerose cellule che formano diversi circuiti neuronali, che costituiscono il primo stadio del percorso visivo. Ogni circuito è caratterizzato da caratteristiche uniche e neurotrasmettitori distinti, che ne determinano il ruolo e il significato funzionale. Dati gli intricati tipi di cellule all’interno della sua struttura, la complessità dei circuiti neuronali nella retina pone sfide per l’esplorazione. Per studiare meglio i circuiti retinici e il cross-talk, come il legame tra le vie del cono e dei bastoncelli, e la precisa localizzazione molecolare (neurotrasmettitori o neuropeptidi), come la presenza di immunoreattività P-like nella retina del topo, abbiamo impiegato un metodo di microscopia immunoelettronica pre-incorporante (immuno-EM) per esplorare le connessioni sinaptiche e l’organizzazione. Questo approccio ci consente di individuare specifiche connessioni sinaptiche intercellulari e una precisa localizzazione molecolare e potrebbe svolgere un ruolo guida nell’esplorazione della sua funzione. Questo articolo descrive il protocollo, i reagenti utilizzati e i passaggi dettagliati, tra cui (1) preparazione della fissazione della retina, (2) immunocolorazione pre-inclusione e (3) post-fissazione e inclusione.
Introduction
La complessità dei circuiti neuronali nella retina presenta sfide per l’esplorazione, considerando i diversi tipi di cellule all’interno della sua struttura 1,2. La fase iniziale prevede l’identificazione delle connessioni sinaptiche tra le diverse cellule e la determinazione della localizzazione cellulare di specifici neurotrasmettitori o neuropeptidi. Con l’avanzare della biologia molecolare che introduce nuove proteine, la localizzazione precisa nella retina diventa fondamentale per comprendere le loro funzioni e analizzare i circuiti retinici e le connessioni sinaptiche 3,4,5.
A causa della risoluzione limitata della microscopia ottica, la microscopia elettronica (EM) è comunemente usata per rilevare le strutture subcellulari delle cellule nervose. EM ha varie classificazioni, con la microscopia elettronica a trasmissione convenzionale (TEM) utilizzata per l’osservazione delle ultrastrutture cellulari 6,7,8,9. La microscopia immunoelettronica (immuno-EM), che combina la risoluzione spaziale dell’EM con la capacità di identificazione chimica degli anticorpi che si legano specificamente alle proteine10, si distingue come il metodo ottimale ed esclusivo per studiare le connessioni sinaptiche e la localizzazione delle proteine subcellulari nella retina11,12.
Le tecniche immuno-EM possono essere suddivise in metodi pre-embedding e post-embedding in base all’ordine di inclusione e incubazione degli anticorpi. Rispetto al metodo post-embedding, l’approccio pre-embedding è in grado di identificare su larga scala e a lunga distanza 13,14,15, offrendo un approccio ottimale per lo studio dei processi cellulari come assoni e dendriti. Inoltre, questa tecnica fornisce un segnale forte e un ampio campo visivo, rendendola vantaggiosa per indagini complete sull’espressione proteica e sulla localizzazione molecolare nel citoplasma. Questo metodo si rivela particolarmente prezioso per garantire strutture chimicamente identificate che siano visibili in tutto il citoplasma, nelle cellule o nella retina.
Tuttavia, il metodo post-embedding, pur avendo una penetrazione o una diffusione inferiore rispetto al metodo pre-embedding, non è così sensibile16,17. In parole povere, se l’obiettivo è quello di esplorare la localizzazione di specifici neurotrasmettitori nel citoplasma o nei terminali sinaptici, l’immuno-EM pre-embedding è il metodo preferito. Al contrario, per identificare la localizzazione dei recettori di membrana, è più raccomandato utilizzare l’immunogold EM post-incorporazione.
Alla luce di queste considerazioni, optiamo per il metodo immuno-EM pre-embedding per approfondire i circuiti retinici, compresa l’interazione tra le vie del cono e dei bastoncelli, e la localizzazione molecolare, come la distribuzione e l’organizzazione sinaptica della sostanza immunoreattività P-like (SP-IR) nella retina del topo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo articolo ha descritto tre passaggi critici per il successo dell’osservazione dei circuiti sinaptici e della localizzazione delle proteine: (1) fissazione rapida e debole, (2) immunocolorazione pre-inclusione e (3) post-fissazione e inclusione.
Proponiamo che la fissazione sia il passo chiave per un approccio immuno-EM pre-incorporamento di successo. Pertanto, qui viene sottolineata l’importanza del fissativo fresco e della fissazione rapida, denominando…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni del National Key Research and Development Program of China (2022YFA1105503), dello State Key Laboratory of Neuroscience (SKLN-202103), della Zhejiang Natural Science Foundation of China (Y21H120019).
Materials
| 1 mL syringe needle | kangdelai | ||
| 1% OsO4 | Electron Microscopy Science | 19100 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| 8% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Science | 16020 | |
| 8% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 157-8 | |
| Acetone | Electron Microscopy Science | 10000 | |
| Anti-rabbit PKC | Sigma-Aldrich | P4334 | |
| Anti-Rabbit SP | Abcam | ab67006 | |
| DAB Substrate kit | MXB Biotechnologies | KIT-9701/9702/9703 | |
| Elbow scissors | Suzhou66 vision company | 54010 | |
| Electron microscope | Phillips | CM120 | |
| Epon resin | Electron Microscopy Science | 14910 | |
| forcep | Suzhou66 vision company | S101A | |
| Millipore filter paper | Merck Millipore | PR05538 | |
| Na2HPO4· 12H2O | Sigma | 71650 | A component of phosphate buffer |
| NaH2PO4· H2O | Sigma | 71507 | A component of phosphate buffer |
| Picric acid | Electron Microscopy Science | 19550 | |
| Sodium borohydride (NaBH4) | Sigma | 215511 | |
| Tris | Solarbio | 917R071 | |
| Ultramicrotome | Leica | ||
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Science | 22400 | |
| VACTASTAIN ABC kit, Peroxidase (Rabbit IgG) | Vector Laboratories | PK-4001 |
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