Investigación de circuitos retinianos y localización molecular mediante microscopía inmunoelectrónica previa a la inclusión
Summary
Este protocolo describe los pasos detallados de la microscopía inmunoelectrónica previa a la incorporación, con un enfoque en la exploración de los circuitos sinápticos y la localización de proteínas en la retina.
Abstract
La retina está formada por numerosas células que forman diversos circuitos neuronales, que constituyen la primera etapa de la vía visual. Cada circuito se caracteriza por características únicas y neurotransmisores distintos, lo que determina su papel e importancia funcional. Dados los intrincados tipos de células dentro de su estructura, la complejidad de los circuitos neuronales en la retina plantea desafíos para la exploración. Para investigar mejor los circuitos de la retina y la diafonía, como el enlace entre las vías del cono y el bastón, y la localización molecular precisa (neurotransmisores o neuropéptidos), como la presencia de inmunorreactividad similar a la sustancia P en la retina del ratón, empleamos un método de microscopía inmunoelectrónica previa a la inclusión (immuno-EM) para explorar las conexiones sinápticas y la organización. Este enfoque nos permite identificar conexiones sinápticas intercelulares específicas y una localización molecular precisa, y podría desempeñar un papel guía en la exploración de su función. En este artículo se describe el protocolo, los reactivos utilizados y los pasos detallados, que incluyen (1) la preparación de la fijación de la retina, (2) la inmunotinción previa a la inserción y (3) la posfijación y la inclusión.
Introduction
La complejidad de los circuitos neuronales en la retina presenta desafíos para la exploración, considerando los diversos tipos de células dentro de su estructura 1,2. El paso inicial consiste en identificar las conexiones sinápticas entre diferentes células y determinar la localización celular de neurotransmisores o neuropéptidos específicos. A medida que los avances de la biología molecular introducen nuevas proteínas, la localización precisa en la retina se vuelve crucial para comprender sus funciones y analizar los circuitos retinianos y las conexiones sinápticas 3,4,5.
Debido a la resolución limitada de la microscopía óptica, la microscopía electrónica (EM) se usa comúnmente para detectar las estructuras subcelulares de las células nerviosas. La EM tiene varias clasificaciones, con la microscopía electrónica de transmisión convencional (TEM) utilizada para observar las ultraestructuras celulares 6,7,8,9. La inmunomicroscopía electrónica (immuno-EM), que combina la resolución espacial de la EM con la capacidad de identificación química de los anticuerpos que se unen específicamente a las proteínas10, se destaca como el método óptimo y exclusivo para investigar las conexiones sinápticas y la localización de proteínas subcelulares en la retina11,12.
Las técnicas de inmuno-EM se pueden dividir en métodos de pre-inclusión y post-incrustación basados en el orden de inclusión y la incubación de anticuerpos. En comparación con el método de post-incrustación, el enfoque de pre-incrustación es capaz de identificar a gran escala y a larga distancia 13,14,15, ofreciendo un enfoque óptimo para el estudio de procesos celulares como axones y dendritas. Además, esta técnica proporciona una señal fuerte y un amplio campo de visión, lo que la hace ventajosa para investigaciones exhaustivas de la expresión de proteínas y la localización molecular en el citoplasma. Este método resulta particularmente valioso para garantizar estructuras identificadas químicamente que son visibles en todo el citoplasma, las células o la retina.
Sin embargo, el método de post-incrustación, a pesar de tener menor penetración o difusión en comparación con el método de pre-incrustación, no es tan sensible16,17. En términos simples, si el objetivo es explorar la localización de neurotransmisores específicos en el citoplasma o en las terminales sinápticas, el inmuno-EM previo a la inclusión es el método preferido. Por el contrario, para identificar la localización de los receptores de membrana, se recomienda utilizar inmunogold EM posterior a la incrustación.
Teniendo en cuenta estas consideraciones, optamos por el método inmuno-EM pre-incrustación para profundizar en los circuitos retinianos, incluyendo la interacción entre las vías del cono y el bastón, y la localización molecular, como la distribución y organización sináptica de la inmunorreactividad tipo sustancia P (SP-IR) en la retina del ratón.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artículo ha descrito tres pasos críticos para la observación exitosa de los circuitos sinápticos y la localización de proteínas: (1) fijación rápida y débil, (2) inmunotinción previa a la inclusión y (3) postfijación e incrustación.
Proponemos que la fijación es el paso clave para el éxito de un enfoque inmuno-EM previo a la incorporación. Por lo tanto, aquí se enfatiza la importancia de un fijador fresco y una fijación rápida, denomina…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado en parte por subvenciones del Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2022YFA1105503), el Laboratorio Estatal Clave de Neurociencia (SKLN-202103), la Fundación de Ciencias Naturales de Zhejiang de China (Y21H120019).
Materials
| 1 mL syringe needle | kangdelai | ||
| 1% OsO4 | Electron Microscopy Science | 19100 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| 8% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Science | 16020 | |
| 8% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 157-8 | |
| Acetone | Electron Microscopy Science | 10000 | |
| Anti-rabbit PKC | Sigma-Aldrich | P4334 | |
| Anti-Rabbit SP | Abcam | ab67006 | |
| DAB Substrate kit | MXB Biotechnologies | KIT-9701/9702/9703 | |
| Elbow scissors | Suzhou66 vision company | 54010 | |
| Electron microscope | Phillips | CM120 | |
| Epon resin | Electron Microscopy Science | 14910 | |
| forcep | Suzhou66 vision company | S101A | |
| Millipore filter paper | Merck Millipore | PR05538 | |
| Na2HPO4· 12H2O | Sigma | 71650 | A component of phosphate buffer |
| NaH2PO4· H2O | Sigma | 71507 | A component of phosphate buffer |
| Picric acid | Electron Microscopy Science | 19550 | |
| Sodium borohydride (NaBH4) | Sigma | 215511 | |
| Tris | Solarbio | 917R071 | |
| Ultramicrotome | Leica | ||
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Science | 22400 | |
| VACTASTAIN ABC kit, Peroxidase (Rabbit IgG) | Vector Laboratories | PK-4001 |
References
- Chua, N. J., et al. A complete reconstruction of the early visual system of an adult insect. Curr Biol. 33 (21), 4611-4623.e4614 (2023).
- Ravi Chander, P., Hanson, L., Chundekkad, L., Awatramani, G. B. Neural circuits underlying multi-feature extraction in the retina. J Neurosci. , (2023).
- Sirivisoot, S., et al. Development and characterization of mouse anti-canine PD-L1 monoclonal antibodies and their expression in canine tumors by immunohistochemistry in vitro. Vet Q. 43 (1), 1-9 (2023).
- Raeisi, H., et al. Development and characterization of phage display-derived anti-toxin antibodies neutralizing TcdA and TcdB of Clostridioides difficile. Microbiol Spectr. 11 (5), e0531022 (2023).
- Ryschich, A., Dong, Y., Schäfer, M., Ryschich, E., Karakhanova, S. DWH24: A new antibody for fluorescence-based cell death analysis. Methods Appl Fluoresc. 11 (4), (2023).
- Jastrzebska, B., et al. Functional characterization of rhodopsin monomers and dimers in detergents. J Biol Chem. 279 (52), 54663-54675 (2004).
- Huang, P., et al. Mechanism of Shenfu injection in suppressing inflammation and preventing sepsis-induced apoptosis in murine cardiomyocytes based on network pharmacology and experimental validation. J Ethnopharmacol. 322, 117599 (2024).
- Maheshwari, U., et al. Inorganic phosphate exporter heterozygosity in mice leads to brain vascular calcification, microangiopathy, and microgliosis. Brain Pathol. 33 (6), e13189 (2023).
- Mackiewicz, J., et al. Effect of gravity in long-term vitreous tamponade: In vivo investigation using perfluorocarbon liquids and semi-fluorinated alkanes. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 245 (5), 665-675 (2007).
- Luján, R., Rubio, M. E. Editorial: Immunoelectron microscopy: Placing molecular functions within a neuronal context. Front Neuroanat. 16, 1043371 (2022).
- Xu, S., et al. Synaptic changes and the response of microglia in a light-induced photoreceptor degeneration model. Mol Vis. 27, 206-220 (2021).
- Chadha, A., Volland, S., Baliaouri, N. V., Tran, E. M., Williams, D. S. The route of the visual receptor rhodopsin along the cilium. J Cell Sci. 132 (10), jcs.229526 (2019).
- Huang, H. J., et al. Multiple nucleocapsid structural forms of shrimp white spot syndrome virus suggests a novel viral morphogenetic pathway. Int J Mol Sci. 24 (8), 7525 (2023).
- Tissarinen, P., et al. Elevated human placental heat shock protein 5 is associated with spontaneous preterm birth. Pediatr Res. 94 (2), 520-529 (2023).
- Huang, Z., et al. A neural tract tracing study on synaptic connections for cortical glutamatergic terminals and cervical spinal calretinin neurons in rats. Front Neural Circuits. 17, 1086873 (2023).
- Zhang, J., Petralia, R. S., Wang, Y. X., Diamond, J. S. High-resolution quantitative immunogold analysis of membrane receptors at retinal ribbon synapses. J Vis Exp. 108, e53547 (2016).
- Ottersen, O. P., Landsend, A. S. Organization of glutamate receptors at the synapse. Eur J Neurosci. 9 (11), 2219-2224 (1997).
- Greferath, U., Grünert, U., Wässle, H. Rod bipolar cells in the mammalian retina show protein kinase C-like immunoreactivity. J Comp Neurol. 301 (3), 433-442 (1990).
- Wang, F., et al. Distribution and synaptic organization of substance P-like immunoreactive neurons in the mouse retina. Brain Struct Funct. 228 (7), 1703-1724 (2023).
- van Opbergen, C. J. M., et al. 34;Orphan" Connexin43 in Plakophilin-2 deficient hearts revealed by volume electron microscopy. Front Cell Dev Biol. 10, 843687 (2022).
- Li, S., et al. Safe and efficient oral allergy immunotherapy using one-pot-prepared mannan-coated allergen nanoparticles. Biomaterials. 303, 122381 (2023).
- Yamashita, K., Kusakabe, M., Sano, M. A simple and rapid method of dissociating hepatocytes from fixed liver of the mouse. Stain Technol. 56 (1), 29-33 (1981).
- Tanabe, T., Shin, M., Fujiwara, K. Immunoelectron microscopy study of polyamines using a newly prepared monoclonal antibody against spermidine: use of a mixture of glutaraldehyde and paraformaldehyde as a cross-linking agent in the preparation of the antigen. J Biochem. 135 (4), 501-507 (2004).
- Xiao, J., et al. Rod bipolar cells receive cone photoreceptor inputs through both invaginating synapses and flat contacts in the mouse and guinea pig retinas. J Comp Neurol. 531 (11), 1184-1197 (2023).
- Yang, Q., et al. Expression of α-Synuclein in the mouse retina is confined to inhibitory presynaptic elements. J Comp Neurol. 531 (10), 1057-1079 (2023).
- Yazulla, S., Studholme, K. M., Zucker, C. L. Synaptic organization of substance P-like immunoreactive amacrine cells in goldfish retina. J Comp Neurol. 231 (2), 232-238 (1985).
- Sassoè-Pognetto, M., Wässle, H., Grünert, U. Glycinergic synapses in the rod pathway of the rat retina: cone bipolar cells express the alpha 1 subunit of the glycine receptor. J Neurosci. 14 (8), 5131-5146 (1994).
- Hartveit, E., et al. Localization and developmental expression of the NMDA receptor subunit NR2A in the mammalian retina. J Comp Neurol. 348 (4), 570-582 (1994).
- Perkins, G. A. The use of miniSOG in the localization of mitochondrial proteins. Methods Enzymol. 547, 165-179 (2014).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS Biol. 9 (4), e1001041 (2011).
- Kar, D., et al. Volume electron microscopy reveals human retinal mitochondria that align with reflective bands in optical coherence tomography [Invited]. Biomed Opt Express. 14 (10), 5512-5527 (2023).
- Johnson, J. E., et al. Spatiotemporal regulation of ATP and Ca2+ dynamics in vertebrate rod and cone ribbon synapses. Mol Vis. 13, 887-919 (2007).
