免疫電子顕微鏡のプレ埋め込みによる網膜回路と分子局在の研究
Summary
このプロトコルでは、網膜のシナプス回路とタンパク質の局在の探索に焦点を当てて、免疫電子顕微鏡のプレ埋め込みの詳細な手順を概説しています。
Abstract
網膜は、視覚経路の第一段階を構成する多様なニューロン回路を形成する多数の細胞から構成されています。各回路は、独自の機能と異なる神経伝達物質によって特徴付けられ、その役割と機能的意義を決定します。その構造内には複雑な細胞タイプがあるため、網膜のニューロン回路の複雑さは、探索に課題をもたらします。網膜回路とクロストーク(錐体経路と桿体経路のリンクなど)、およびマウス網膜におけるサブスタンスP様免疫反応性の存在などの正確な分子局在(神経伝達物質または神経ペプチド)をより詳細に調査するために、シナプスの結合と組織化を探索するために、プレエンベッド免疫電子顕微鏡(免疫電子顕微鏡)法を採用しました。このアプローチにより、特定の細胞間シナプス結合と正確な分子局在を特定することができ、その機能を探求する上での指針となる可能性があります。この記事では、(1)網膜固定の準備、(2)包埋前の免疫染色、(3)固定後の包埋など、プロトコール、使用する試薬、および詳細な手順について説明します。
Introduction
網膜の神経回路の複雑さは、その構造内の多様な細胞タイプを考慮すると、探索の課題を提示します1,2。最初のステップでは、異なる細胞間のシナプス結合を特定し、特定の神経伝達物質または神経ペプチドの細胞局在を決定します。分子生物学の進歩により新しいタンパク質が導入されるにつれて、網膜における正確な局在化は、その機能を理解し、網膜回路とシナプス結合を解析するために重要になる3,4,5。
光学顕微鏡の分解能には限界があるため、神経細胞の細胞内構造を検出するために電子顕微鏡(EM)が一般的に使用されます。電磁界には様々な分類があり、従来の透過型電子顕微鏡(TEM)は細胞の超微細構造の観察に利用されていました6,7,8,9。免疫電子顕微鏡(immuno-EM)は、EMの空間分解能とタンパク質10に特異的に結合する抗体の化学的同定能力を兼ね備えており、網膜11,12におけるシナプス結合および細胞内タンパク質局在を調査するための最適かつ排他的な方法として際立っている。
Immuno-EM技術は、エンベッドと抗体インキュベーションの順序に基づいて、プレエンベッド法とポストエンベッド法に分けることができます。ポストエンベッド法と比較して、プレエンベッド法は、大規模かつ長距離の同定が可能であり13,14,15、軸索や樹状突起などの細胞プロセスを研究するための最適なアプローチを提供する。さらに、この手法は強力なシグナルと広い視野を提供するため、細胞質内のタンパク質発現と分子局在の包括的な研究に有利です。この方法は、細胞質、細胞、または網膜全体にわたって見える化学的に同定された構造を確保するのに特に価値があることが証明されています。
しかし、ポストエンベッディング法は、プレエンベッド法に比べて浸透または拡散が小さい一方で、感度はそれほど高くない16,17。簡単に言えば、細胞質またはシナプス末端における特定の神経伝達物質の局在を探求することが目標である場合、プレエンベッド免疫EMが好ましい方法です。逆に、膜受容体の局在を特定するには、埋め込み後のイムノゴールドEMを利用することがより推奨されます。
これらのことを考慮して、錐体経路と桿体経路の間の相互作用を含む網膜回路と、マウス網膜における物質P様免疫反応性(SP-IR)の分布やシナプス組織化などの分子局在を解明するために、プレエンベッド免疫電子顕微鏡法を選択します。
Protocol
Representative Results
Discussion
この記事では、シナプス回路とタンパク質の局在をうまく観察するための3つの重要なステップ、(1)迅速および弱い固定、(2)免疫染色のプレエンベッド、および(3)ポスト固定とインベッドについて説明しました。
私たちは、固定化がプレエンベッド免疫EMアプローチを成功させるための重要なステップであることを提案します。したがって、ここ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、National Key Research and Development Program of China(2022YFA1105503)、State Key Laboratory of Neuroscience(SKLN-202103)、Zhejiang Natural Science Foundation of China(Y21H120019)からの助成金によって部分的に支援されました。
Materials
| 1 mL syringe needle | kangdelai | ||
| 1% OsO4 | Electron Microscopy Science | 19100 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| 8% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Science | 16020 | |
| 8% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 157-8 | |
| Acetone | Electron Microscopy Science | 10000 | |
| Anti-rabbit PKC | Sigma-Aldrich | P4334 | |
| Anti-Rabbit SP | Abcam | ab67006 | |
| DAB Substrate kit | MXB Biotechnologies | KIT-9701/9702/9703 | |
| Elbow scissors | Suzhou66 vision company | 54010 | |
| Electron microscope | Phillips | CM120 | |
| Epon resin | Electron Microscopy Science | 14910 | |
| forcep | Suzhou66 vision company | S101A | |
| Millipore filter paper | Merck Millipore | PR05538 | |
| Na2HPO4· 12H2O | Sigma | 71650 | A component of phosphate buffer |
| NaH2PO4· H2O | Sigma | 71507 | A component of phosphate buffer |
| Picric acid | Electron Microscopy Science | 19550 | |
| Sodium borohydride (NaBH4) | Sigma | 215511 | |
| Tris | Solarbio | 917R071 | |
| Ultramicrotome | Leica | ||
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Science | 22400 | |
| VACTASTAIN ABC kit, Peroxidase (Rabbit IgG) | Vector Laboratories | PK-4001 |
References
- Chua, N. J., et al. A complete reconstruction of the early visual system of an adult insect. Curr Biol. 33 (21), 4611-4623.e4614 (2023).
- Ravi Chander, P., Hanson, L., Chundekkad, L., Awatramani, G. B. Neural circuits underlying multi-feature extraction in the retina. J Neurosci. , (2023).
- Sirivisoot, S., et al. Development and characterization of mouse anti-canine PD-L1 monoclonal antibodies and their expression in canine tumors by immunohistochemistry in vitro. Vet Q. 43 (1), 1-9 (2023).
- Raeisi, H., et al. Development and characterization of phage display-derived anti-toxin antibodies neutralizing TcdA and TcdB of Clostridioides difficile. Microbiol Spectr. 11 (5), e0531022 (2023).
- Ryschich, A., Dong, Y., Schäfer, M., Ryschich, E., Karakhanova, S. DWH24: A new antibody for fluorescence-based cell death analysis. Methods Appl Fluoresc. 11 (4), (2023).
- Jastrzebska, B., et al. Functional characterization of rhodopsin monomers and dimers in detergents. J Biol Chem. 279 (52), 54663-54675 (2004).
- Huang, P., et al. Mechanism of Shenfu injection in suppressing inflammation and preventing sepsis-induced apoptosis in murine cardiomyocytes based on network pharmacology and experimental validation. J Ethnopharmacol. 322, 117599 (2024).
- Maheshwari, U., et al. Inorganic phosphate exporter heterozygosity in mice leads to brain vascular calcification, microangiopathy, and microgliosis. Brain Pathol. 33 (6), e13189 (2023).
- Mackiewicz, J., et al. Effect of gravity in long-term vitreous tamponade: In vivo investigation using perfluorocarbon liquids and semi-fluorinated alkanes. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 245 (5), 665-675 (2007).
- Luján, R., Rubio, M. E. Editorial: Immunoelectron microscopy: Placing molecular functions within a neuronal context. Front Neuroanat. 16, 1043371 (2022).
- Xu, S., et al. Synaptic changes and the response of microglia in a light-induced photoreceptor degeneration model. Mol Vis. 27, 206-220 (2021).
- Chadha, A., Volland, S., Baliaouri, N. V., Tran, E. M., Williams, D. S. The route of the visual receptor rhodopsin along the cilium. J Cell Sci. 132 (10), jcs.229526 (2019).
- Huang, H. J., et al. Multiple nucleocapsid structural forms of shrimp white spot syndrome virus suggests a novel viral morphogenetic pathway. Int J Mol Sci. 24 (8), 7525 (2023).
- Tissarinen, P., et al. Elevated human placental heat shock protein 5 is associated with spontaneous preterm birth. Pediatr Res. 94 (2), 520-529 (2023).
- Huang, Z., et al. A neural tract tracing study on synaptic connections for cortical glutamatergic terminals and cervical spinal calretinin neurons in rats. Front Neural Circuits. 17, 1086873 (2023).
- Zhang, J., Petralia, R. S., Wang, Y. X., Diamond, J. S. High-resolution quantitative immunogold analysis of membrane receptors at retinal ribbon synapses. J Vis Exp. 108, e53547 (2016).
- Ottersen, O. P., Landsend, A. S. Organization of glutamate receptors at the synapse. Eur J Neurosci. 9 (11), 2219-2224 (1997).
- Greferath, U., Grünert, U., Wässle, H. Rod bipolar cells in the mammalian retina show protein kinase C-like immunoreactivity. J Comp Neurol. 301 (3), 433-442 (1990).
- Wang, F., et al. Distribution and synaptic organization of substance P-like immunoreactive neurons in the mouse retina. Brain Struct Funct. 228 (7), 1703-1724 (2023).
- van Opbergen, C. J. M., et al. 34;Orphan" Connexin43 in Plakophilin-2 deficient hearts revealed by volume electron microscopy. Front Cell Dev Biol. 10, 843687 (2022).
- Li, S., et al. Safe and efficient oral allergy immunotherapy using one-pot-prepared mannan-coated allergen nanoparticles. Biomaterials. 303, 122381 (2023).
- Yamashita, K., Kusakabe, M., Sano, M. A simple and rapid method of dissociating hepatocytes from fixed liver of the mouse. Stain Technol. 56 (1), 29-33 (1981).
- Tanabe, T., Shin, M., Fujiwara, K. Immunoelectron microscopy study of polyamines using a newly prepared monoclonal antibody against spermidine: use of a mixture of glutaraldehyde and paraformaldehyde as a cross-linking agent in the preparation of the antigen. J Biochem. 135 (4), 501-507 (2004).
- Xiao, J., et al. Rod bipolar cells receive cone photoreceptor inputs through both invaginating synapses and flat contacts in the mouse and guinea pig retinas. J Comp Neurol. 531 (11), 1184-1197 (2023).
- Yang, Q., et al. Expression of α-Synuclein in the mouse retina is confined to inhibitory presynaptic elements. J Comp Neurol. 531 (10), 1057-1079 (2023).
- Yazulla, S., Studholme, K. M., Zucker, C. L. Synaptic organization of substance P-like immunoreactive amacrine cells in goldfish retina. J Comp Neurol. 231 (2), 232-238 (1985).
- Sassoè-Pognetto, M., Wässle, H., Grünert, U. Glycinergic synapses in the rod pathway of the rat retina: cone bipolar cells express the alpha 1 subunit of the glycine receptor. J Neurosci. 14 (8), 5131-5146 (1994).
- Hartveit, E., et al. Localization and developmental expression of the NMDA receptor subunit NR2A in the mammalian retina. J Comp Neurol. 348 (4), 570-582 (1994).
- Perkins, G. A. The use of miniSOG in the localization of mitochondrial proteins. Methods Enzymol. 547, 165-179 (2014).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS Biol. 9 (4), e1001041 (2011).
- Kar, D., et al. Volume electron microscopy reveals human retinal mitochondria that align with reflective bands in optical coherence tomography [Invited]. Biomed Opt Express. 14 (10), 5512-5527 (2023).
- Johnson, J. E., et al. Spatiotemporal regulation of ATP and Ca2+ dynamics in vertebrate rod and cone ribbon synapses. Mol Vis. 13, 887-919 (2007).
