Untersuchung von retinalen Schaltkreisen und molekularer Lokalisierung durch Voreinbettung der Immunelektronenmikroskopie
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die detaillierten Schritte der Immunelektronenmikroskopie vor der Einbettung, wobei der Schwerpunkt auf der Erforschung synaptischer Schaltkreise und der Proteinlokalisierung in der Netzhaut liegt.
Abstract
Die Netzhaut besteht aus zahlreichen Zellen, die verschiedene neuronale Schaltkreise bilden, die die erste Stufe der Sehbahn bilden. Jeder Schaltkreis zeichnet sich durch einzigartige Merkmale und unterschiedliche Neurotransmitter aus, die seine Rolle und funktionelle Bedeutung bestimmen. Angesichts der komplizierten Zelltypen innerhalb ihrer Struktur stellt die Komplexität der neuronalen Schaltkreise in der Netzhaut eine Herausforderung für die Erforschung dar. Um retinale Schaltkreise und Cross-Talks, wie z.B. die Verbindung zwischen Zapfen- und Stäbchenwegen, und die genaue molekulare Lokalisierung (Neurotransmitter oder Neuropeptide), wie z.B. das Vorhandensein von Substanz P-ähnlicher Immunreaktivität in der Netzhaut der Maus, besser untersuchen zu können, haben wir eine Pre-Embedding-Immunelektronenmikroskopie (Immuno-EM) Methode eingesetzt, um synaptische Verbindungen und Organisation zu untersuchen. Dieser Ansatz ermöglicht es uns, spezifische interzelluläre synaptische Verbindungen und eine präzise molekulare Lokalisierung zu lokalisieren und könnte eine richtungsweisende Rolle bei der Erforschung seiner Funktion spielen. Dieser Artikel beschreibt das Protokoll, die verwendeten Reagenzien und detaillierte Schritte, einschließlich (1) Vorbereitung der Netzhautfixierung, (2) Immunfärbung vor der Einbettung und (3) Nachfixierung und Einbettung.
Introduction
Die Komplexität der neuronalen Schaltkreise in der Netzhaut stellt eine Herausforderung für die Erforschung dar, wenn man die unterschiedlichen Zelltypen innerhalb ihrer Struktur berücksichtigt 1,2. In einem ersten Schritt geht es darum, synaptische Verbindungen zwischen verschiedenen Zellen zu identifizieren und die zelluläre Lokalisation bestimmter Neurotransmitter oder Neuropeptide zu bestimmen. Mit den Fortschritten in der Molekularbiologie und der Einführung neuer Proteine wird die präzise Lokalisierung in der Netzhaut entscheidend für das Verständnis ihrer Funktionen und die Analyse von retinalen Schaltkreisen und synaptischen Verbindungen 3,4,5.
Aufgrund der begrenzten Auflösung der Lichtmikroskopie wird die Elektronenmikroskopie (EM) häufig eingesetzt, um die subzellulären Strukturen von Nervenzellen zu detektieren. EM hat verschiedene Klassifikationen, wobei die konventionelle Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) zur Beobachtung von Zellultrastrukturen verwendet wird 6,7,8,9. Die Immunelektronenmikroskopie (Immuno-EM), die die räumliche Auflösung der EM mit der chemischen Identifizierungsfähigkeit von Antikörpern kombiniert, die spezifisch an Proteinebinden 10, erweist sich als die optimale und exklusive Methode zur Untersuchung synaptischer Verbindungen und der subzellulären Proteinlokalisation in der Netzhaut11,12.
Immun-EM-Techniken können in Prä-Embedding- und Post-Embedding-Methoden unterteilt werden, basierend auf der Reihenfolge der Einbettung und der Antikörperinkubation. Im Vergleich zur Post-Embedding-Methode ist der Pre-Embedding-Ansatz in der Lage, großflächig und über große Entfernungen zu identifizieren 13,14,15 und bietet einen optimalen Ansatz für die Untersuchung von Zellprozessen wie Axonen und Dendriten. Darüber hinaus bietet diese Technik ein starkes Signal und ein breites Sichtfeld, was sie für umfassende Untersuchungen der Proteinexpression und der molekularen Lokalisation im Zytoplasma vorteilhaft macht. Diese Methode erweist sich als besonders wertvoll, um chemisch identifizierte Strukturen zu gewährleisten, die im gesamten Zytoplasma, in den Zellen oder in der Netzhaut sichtbar sind.
Die Post-Embedding-Methode weist zwar eine geringere Penetration oder Diffusion im Vergleich zur Pre-Embedding-Methode auf, ist jedoch nicht so empfindlich16,17. Einfach ausgedrückt: Wenn das Ziel darin besteht, die Lokalisation spezifischer Neurotransmitter im Zytoplasma oder in den synaptischen Endungen zu untersuchen, ist die Pre-Embedding-Immuno-EM die bevorzugte Methode. Umgekehrt wird zur Identifizierung der Lokalisation von Membranrezeptoren eher empfohlen, Immunogold-EM nach der Einbettung zu verwenden.
Vor diesem Hintergrund entscheiden wir uns für die Pre-Embedding-Immuno-EM-Methode, um in retinale Schaltkreise einzutauchen, einschließlich der Interaktion zwischen Zapfen- und Stäbchenwegen, und der molekularen Lokalisation, wie z. B. der Verteilung und synaptischen Organisation der Substanz P-like Immunoreactivity (SP-IR) in der Netzhaut der Maus.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Artikel wurden drei kritische Schritte für die erfolgreiche Beobachtung synaptischer Schaltkreise und der Proteinlokalisierung beschrieben: (1) schnelle und schwache Fixierung, (2) Immunfärbung vor der Einbettung und (3) Nachfixierung und Einbettung.
Wir gehen davon aus, dass die Fixierung der Schlüsselschritt für einen erfolgreichen Ansatz vor der Einbettung von Immuno-EM ist. Daher wird hier die Bedeutung von frischem Fixiermittel und schneller…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde teilweise durch Zuschüsse des National Key Research and Development Program of China (2022YFA1105503), des State Key Laboratory of Neuroscience (SKLN-202103) und der Zhejiang Natural Science Foundation of China (Y21H120019) unterstützt.
Materials
| 1 mL syringe needle | kangdelai | ||
| 1% OsO4 | Electron Microscopy Science | 19100 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| 8% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Science | 16020 | |
| 8% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 157-8 | |
| Acetone | Electron Microscopy Science | 10000 | |
| Anti-rabbit PKC | Sigma-Aldrich | P4334 | |
| Anti-Rabbit SP | Abcam | ab67006 | |
| DAB Substrate kit | MXB Biotechnologies | KIT-9701/9702/9703 | |
| Elbow scissors | Suzhou66 vision company | 54010 | |
| Electron microscope | Phillips | CM120 | |
| Epon resin | Electron Microscopy Science | 14910 | |
| forcep | Suzhou66 vision company | S101A | |
| Millipore filter paper | Merck Millipore | PR05538 | |
| Na2HPO4· 12H2O | Sigma | 71650 | A component of phosphate buffer |
| NaH2PO4· H2O | Sigma | 71507 | A component of phosphate buffer |
| Picric acid | Electron Microscopy Science | 19550 | |
| Sodium borohydride (NaBH4) | Sigma | 215511 | |
| Tris | Solarbio | 917R071 | |
| Ultramicrotome | Leica | ||
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Science | 22400 | |
| VACTASTAIN ABC kit, Peroxidase (Rabbit IgG) | Vector Laboratories | PK-4001 |
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