İmmünoelektron Mikroskobunun Önceden Gömülmesi ile Retina Devrelerinin ve Moleküler Lokalizasyonun İncelenmesi
Summary
Bu protokol, retinadaki sinaptik devreleri ve protein lokalizasyonunu keşfetmeye odaklanarak, önceden gömülü immünoelektron mikroskobunun ayrıntılı adımlarını ana hatlarıyla belirtir.
Abstract
Retina, görme yolunun ilk aşamasını oluşturan çeşitli nöronal devreler oluşturan çok sayıda hücreden oluşur. Her devre, rolünü ve işlevsel önemini belirleyen benzersiz özellikler ve farklı nörotransmiterler ile karakterize edilir. Yapısındaki karmaşık hücre tipleri göz önüne alındığında, retinadaki nöronal devrelerin karmaşıklığı keşif için zorluklar doğurur. Koni ve çubuk yolları arasındaki bağlantı gibi retina devrelerini ve çapraz konuşmayı ve fare retinasında P benzeri immünoreaktivite maddesinin varlığı gibi kesin moleküler lokalizasyonu (nörotransmiterler veya nöropeptitler) daha iyi araştırmak için, sinaptik bağlantıları ve organizasyonu keşfetmek için önceden gömülü bir immünoelektron mikroskobu (immüno-EM) yöntemi kullandık. Bu yaklaşım, spesifik hücreler arası sinaptik bağlantıları ve kesin moleküler lokalizasyonu belirlememizi sağlar ve işlevini keşfetmede yol gösterici bir rol oynayabilir. Bu makale, (1) retina fiksasyon hazırlığı, (2) ön gömme immün boyama ve (3) sabitleme sonrası ve gömme dahil olmak üzere protokolü, kullanılan reaktifleri ve ayrıntılı adımları açıklamaktadır.
Introduction
Retinadaki nöronal devrelerin karmaşıklığı, yapısındaki çeşitli hücre tipleri göz önüne alındığında, keşif için zorluklar ortaya çıkarmaktadır 1,2. İlk adım, farklı hücreler arasındaki sinaptik bağlantıların tanımlanmasını ve spesifik nörotransmiterlerin veya nöropeptitlerin hücresel lokalizasyonunun belirlenmesini içerir. Moleküler biyolojideki ilerlemeler yeni proteinleri tanıttıkça, retinadaki hassas lokalizasyon, işlevlerini anlamak ve retina devrelerini ve sinaptik bağlantıları analiz etmek için çok önemli hale gelir 3,4,5.
Işık mikroskobunun sınırlı çözünürlüğü nedeniyle, elektron mikroskobu (EM), sinir hücrelerinin hücre altı yapılarını tespit etmek için yaygın olarak kullanılır. EM, hücre ultrayapılarınıgözlemlemek için kullanılan geleneksel transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile çeşitli sınıflandırmalara sahiptir 6,7,8,9. EM’nin uzamsal çözünürlüğünü, spesifik olarak proteinlere10 bağlanan antikorların kimyasal tanımlama yeteneği ile birleştiren immünoelektron mikroskobu (immüno-EM), retinadaki sinaptik bağlantıları ve hücre altı protein lokalizasyonunu araştırmak için en uygun ve özel yöntem olarak öne çıkmaktadır11,12.
İmmüno-EM teknikleri, gömme ve antikor inkübasyon sırasına bağlı olarak gömme öncesi ve sonrası gömme yöntemlerine ayrılabilir. Gömme sonrası yöntemle karşılaştırıldığında, ön gömme yaklaşımı, aksonlar ve dendritler gibi hücre süreçlerini incelemek için en uygun yaklaşımı sunan büyük ölçekli ve uzun mesafeli tanımlama 13,14,15 yeteneğine sahiptir. Ek olarak, bu teknik, güçlü bir sinyal ve geniş bir görüş alanı sağlayarak, sitoplazmada protein ekspresyonu ve moleküler lokalizasyonun kapsamlı araştırmaları için avantajlı hale getirir. Bu yöntem, tüm sitoplazma, hücreler veya retina boyunca görülebilen kimyasal olarak tanımlanmış yapıların sağlanmasında özellikle değerli olduğunu kanıtlamaktadır.
Bununla birlikte, gömme sonrası yöntem, gömme öncesi yönteme kıyasla daha düşük penetrasyon veya difüzyona sahip olsa da, o kadar hassas değildir16,17. Basit bir ifadeyle, amaç sitoplazma veya sinaptik terminallerdeki spesifik nörotransmiterlerin lokalizasyonunu araştırmaksa, önceden gömülü immüno-EM tercih edilen yöntemdir. Tersine, membran reseptörlerinin lokalizasyonunu tanımlamak için, gömme sonrası immünogold EM’nin kullanılması daha fazla tavsiye edilir.
Bu hususlar göz önüne alındığında, koni ve çubuk yolları arasındaki etkileşim ve fare retinasındaki P benzeri immünoreaktivitenin (SP-IR) dağılımı ve sinaptik organizasyonu gibi moleküler lokalizasyon dahil olmak üzere retina devrelerini araştırmak için önceden gömme immüno-EM yöntemini tercih ediyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makale, sinaptik devrelerin ve protein lokalizasyonunun başarılı bir şekilde gözlemlenmesi için üç kritik adımı tanımlamıştır: (1) hızlı ve zayıf fiksasyon, (2) ön gömme immün boyama ve (3) fiksasyon sonrası ve gömme.
Fiksasyonun, başarılı bir pre-embedding immüno-EM yaklaşımı için anahtar adım olduğunu öneriyoruz. Bu nedenle, burada taze fiksatif ve hızlı fiksasyonun önemi vurgulanmakta ve bu ilkeye doku hazırlığında…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma kısmen Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2022YFA1105503), Devlet Nörobilim Anahtar Laboratuvarı (SKLN-202103), Çin Zhejiang Doğa Bilimleri Vakfı (Y21H120019) Hibeleri ile desteklenmiştir.
Materials
| 1 mL syringe needle | kangdelai | ||
| 1% OsO4 | Electron Microscopy Science | 19100 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| 8% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Science | 16020 | |
| 8% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 157-8 | |
| Acetone | Electron Microscopy Science | 10000 | |
| Anti-rabbit PKC | Sigma-Aldrich | P4334 | |
| Anti-Rabbit SP | Abcam | ab67006 | |
| DAB Substrate kit | MXB Biotechnologies | KIT-9701/9702/9703 | |
| Elbow scissors | Suzhou66 vision company | 54010 | |
| Electron microscope | Phillips | CM120 | |
| Epon resin | Electron Microscopy Science | 14910 | |
| forcep | Suzhou66 vision company | S101A | |
| Millipore filter paper | Merck Millipore | PR05538 | |
| Na2HPO4· 12H2O | Sigma | 71650 | A component of phosphate buffer |
| NaH2PO4· H2O | Sigma | 71507 | A component of phosphate buffer |
| Picric acid | Electron Microscopy Science | 19550 | |
| Sodium borohydride (NaBH4) | Sigma | 215511 | |
| Tris | Solarbio | 917R071 | |
| Ultramicrotome | Leica | ||
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Science | 22400 | |
| VACTASTAIN ABC kit, Peroxidase (Rabbit IgG) | Vector Laboratories | PK-4001 |
References
- Chua, N. J., et al. A complete reconstruction of the early visual system of an adult insect. Curr Biol. 33 (21), 4611-4623.e4614 (2023).
- Ravi Chander, P., Hanson, L., Chundekkad, L., Awatramani, G. B. Neural circuits underlying multi-feature extraction in the retina. J Neurosci. , (2023).
- Sirivisoot, S., et al. Development and characterization of mouse anti-canine PD-L1 monoclonal antibodies and their expression in canine tumors by immunohistochemistry in vitro. Vet Q. 43 (1), 1-9 (2023).
- Raeisi, H., et al. Development and characterization of phage display-derived anti-toxin antibodies neutralizing TcdA and TcdB of Clostridioides difficile. Microbiol Spectr. 11 (5), e0531022 (2023).
- Ryschich, A., Dong, Y., Schäfer, M., Ryschich, E., Karakhanova, S. DWH24: A new antibody for fluorescence-based cell death analysis. Methods Appl Fluoresc. 11 (4), (2023).
- Jastrzebska, B., et al. Functional characterization of rhodopsin monomers and dimers in detergents. J Biol Chem. 279 (52), 54663-54675 (2004).
- Huang, P., et al. Mechanism of Shenfu injection in suppressing inflammation and preventing sepsis-induced apoptosis in murine cardiomyocytes based on network pharmacology and experimental validation. J Ethnopharmacol. 322, 117599 (2024).
- Maheshwari, U., et al. Inorganic phosphate exporter heterozygosity in mice leads to brain vascular calcification, microangiopathy, and microgliosis. Brain Pathol. 33 (6), e13189 (2023).
- Mackiewicz, J., et al. Effect of gravity in long-term vitreous tamponade: In vivo investigation using perfluorocarbon liquids and semi-fluorinated alkanes. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 245 (5), 665-675 (2007).
- Luján, R., Rubio, M. E. Editorial: Immunoelectron microscopy: Placing molecular functions within a neuronal context. Front Neuroanat. 16, 1043371 (2022).
- Xu, S., et al. Synaptic changes and the response of microglia in a light-induced photoreceptor degeneration model. Mol Vis. 27, 206-220 (2021).
- Chadha, A., Volland, S., Baliaouri, N. V., Tran, E. M., Williams, D. S. The route of the visual receptor rhodopsin along the cilium. J Cell Sci. 132 (10), jcs.229526 (2019).
- Huang, H. J., et al. Multiple nucleocapsid structural forms of shrimp white spot syndrome virus suggests a novel viral morphogenetic pathway. Int J Mol Sci. 24 (8), 7525 (2023).
- Tissarinen, P., et al. Elevated human placental heat shock protein 5 is associated with spontaneous preterm birth. Pediatr Res. 94 (2), 520-529 (2023).
- Huang, Z., et al. A neural tract tracing study on synaptic connections for cortical glutamatergic terminals and cervical spinal calretinin neurons in rats. Front Neural Circuits. 17, 1086873 (2023).
- Zhang, J., Petralia, R. S., Wang, Y. X., Diamond, J. S. High-resolution quantitative immunogold analysis of membrane receptors at retinal ribbon synapses. J Vis Exp. 108, e53547 (2016).
- Ottersen, O. P., Landsend, A. S. Organization of glutamate receptors at the synapse. Eur J Neurosci. 9 (11), 2219-2224 (1997).
- Greferath, U., Grünert, U., Wässle, H. Rod bipolar cells in the mammalian retina show protein kinase C-like immunoreactivity. J Comp Neurol. 301 (3), 433-442 (1990).
- Wang, F., et al. Distribution and synaptic organization of substance P-like immunoreactive neurons in the mouse retina. Brain Struct Funct. 228 (7), 1703-1724 (2023).
- van Opbergen, C. J. M., et al. 34;Orphan" Connexin43 in Plakophilin-2 deficient hearts revealed by volume electron microscopy. Front Cell Dev Biol. 10, 843687 (2022).
- Li, S., et al. Safe and efficient oral allergy immunotherapy using one-pot-prepared mannan-coated allergen nanoparticles. Biomaterials. 303, 122381 (2023).
- Yamashita, K., Kusakabe, M., Sano, M. A simple and rapid method of dissociating hepatocytes from fixed liver of the mouse. Stain Technol. 56 (1), 29-33 (1981).
- Tanabe, T., Shin, M., Fujiwara, K. Immunoelectron microscopy study of polyamines using a newly prepared monoclonal antibody against spermidine: use of a mixture of glutaraldehyde and paraformaldehyde as a cross-linking agent in the preparation of the antigen. J Biochem. 135 (4), 501-507 (2004).
- Xiao, J., et al. Rod bipolar cells receive cone photoreceptor inputs through both invaginating synapses and flat contacts in the mouse and guinea pig retinas. J Comp Neurol. 531 (11), 1184-1197 (2023).
- Yang, Q., et al. Expression of α-Synuclein in the mouse retina is confined to inhibitory presynaptic elements. J Comp Neurol. 531 (10), 1057-1079 (2023).
- Yazulla, S., Studholme, K. M., Zucker, C. L. Synaptic organization of substance P-like immunoreactive amacrine cells in goldfish retina. J Comp Neurol. 231 (2), 232-238 (1985).
- Sassoè-Pognetto, M., Wässle, H., Grünert, U. Glycinergic synapses in the rod pathway of the rat retina: cone bipolar cells express the alpha 1 subunit of the glycine receptor. J Neurosci. 14 (8), 5131-5146 (1994).
- Hartveit, E., et al. Localization and developmental expression of the NMDA receptor subunit NR2A in the mammalian retina. J Comp Neurol. 348 (4), 570-582 (1994).
- Perkins, G. A. The use of miniSOG in the localization of mitochondrial proteins. Methods Enzymol. 547, 165-179 (2014).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS Biol. 9 (4), e1001041 (2011).
- Kar, D., et al. Volume electron microscopy reveals human retinal mitochondria that align with reflective bands in optical coherence tomography [Invited]. Biomed Opt Express. 14 (10), 5512-5527 (2023).
- Johnson, J. E., et al. Spatiotemporal regulation of ATP and Ca2+ dynamics in vertebrate rod and cone ribbon synapses. Mol Vis. 13, 887-919 (2007).
