Aislamiento rápido de ovocitos en estadio I en pez cebra desprovistos de células granulosas
Summary
Este protocolo describe un procedimiento modificado para aislar rápidamente ovocitos limpios en etapa I en pez cebra desprovistos de células de granulosa, proporcionando así un método conveniente para la investigación específica de ovocitos.
Abstract
El estudio del desarrollo de los ovocitos tiene implicaciones significativas en la biología del desarrollo. El pez cebra (Danio rerio) se ha utilizado ampliamente como organismo modelo para investigar los procesos tempranos de desarrollo desde el ovocito hasta el embrión. En el pez cebra, los ovocitos están rodeados por una sola capa de células somáticas de la granulosa. Sin embargo, separar las células de la granulosa de los ovocitos supone un reto, ya que conseguir ovocitos puros es crucial para un análisis preciso. Aunque se han propuesto varios métodos para aislar ovocitos de pez cebra en diferentes etapas de desarrollo, las técnicas actuales se quedan cortas para eliminar completamente las células de la granulosa, lo que limita la precisión del análisis del genoma centrado únicamente en los ovocitos. En este estudio, desarrollamos con éxito un proceso rápido y eficiente para aislar ovocitos puros en etapa I en pez cebra mientras eliminamos la contaminación de las células de la granulosa. Esta técnica facilita el análisis bioquímico y molecular, particularmente en la exploración de aspectos epigenéticos y de la estructura del genoma específicos de los ovocitos. En particular, el método es fácil de usar, minimiza el daño de los ovocitos y proporciona una solución práctica para la investigación y el análisis posteriores.
Introduction
El pez cebra es uno de los sistemas modelo más importantes en biología del desarrollo. En los últimos años, numerosos estudios han utilizado el pez cebra como modelo para estudiar importantes eventos biológicos y procesos reguladores desde el ovocito hasta el embrión. Estos abarcan los intrincados procesos de desarrollo y maduración de los ovocitos1, la funcionalidad de los genes maternos2, la regulación de las transiciones materno-cigóticas3 y extensos análisis ómicos4.
Las células de la granulosa, las células somáticas que envuelven y nutren al ovocito en desarrollo dentro del folículo ovárico 5,6, desempeñan un papel fundamental en este proceso de desarrollo. A medida que las células germinales primordiales (PGC) evolucionan hacia la oogonía, quedan rodeadas por una monocapa de células de la granulosa7. Junto con las células tecales externas, el ovocito y las células de la granulosa circundantes constituyen un folículo maduro8. Dada la distinción fundamental entre células germinales y células somáticas, es imperativo obtener una muestra de ovocitos puros, especialmente para los análisis relacionados con el genoma.
Dentro de la estructura folicular del pez cebra, las células de la granulosa suelen exhibir un diámetro de solo unas pocas micras8, lo que enfatiza la íntima interconexión entre las células de la granulosa y los ovocitos9. Esta estrecha asociación presenta un desafío para lograr la separación completa debido a la considerable diferencia tanto en el número como en el volumen de células de la granulosa frente a los ovocitos (cientos de células de la granulosa en comparación con un solo ovocito)10,11. Incluso una contaminación mínima con una sola célula de la granulosa puede impedir los análisis posteriores dirigidos específicamente a los ovocitos. Por lo tanto, para los estudios centrados en las características genómicas y epigenéticas, la eliminación de las células de la granulosa es esencial.
Beneficiándose de criterios morfológicos bien caracterizados, los ovocitos en cada estadio se pueden distinguir en función del diámetro11. El proceso de ovogénesis en el pez cebra se categoriza en cinco etapas según la morfología y el cariotipo11. Los ovocitos en estadio I (7-140 μm de diámetro) abarcan los ovocitos desde el inicio de la meiosis hasta la fase temprana de la meiosis I. Fundamentalmente, estos ovocitos son transparentes, lo que permite la observación del núcleo central a través de la luz transmitida (Figura 1Ai). Los ovocitos en estadio II (140-340 μm de diámetro) se vuelven gradualmente espumosos y translúcidos. Con el agrandamiento de los folículos y la proliferación de alvéolos corticales, las vesículas germinales en el centro se vuelven difíciles de distinguir12 (Figura 1Aii). Los ovocitos en estadio III (340-690 μm de diámetro) acumulan progresivamente vitelogenina y los folículos frescos se vuelven cada vez más opacos (Figura 1Aiii). La meiosis continúa en los ovocitos en estadio IV (690-730 μm de diámetro) cuando los cromosomas entran en la mitad de la meiosis II, donde se estancan (Figura 1Aiv). Los ovocitos en estadio V (730-750 μm de diámetro) han madurado y están listos para la ovulación 7,11 (Figura 1Av).
Con base en las características únicas de cada uno de los estadios antes mencionados, se ha propuesto un método para aislar ovocitos de los estadios I a III mediante la digestión de ovarios de pez cebra utilizando una solución digestiva que contiene colagenasa I, colagenasa II e hialuronidasa, seguida de filtración a través de un filtro celular de tamaño específico13. Sin embargo, aunque este método permite obtener ovocitos en diferentes etapas de desarrollo, no logra separar completamente los ovocitos y las células de la granulosa. Otros investigadores también han sugerido métodos para separar las células de la granulosa de los ovocitos. Sin embargo, estos métodos se basan principalmente en abordajes mecánicos, que pueden causar daño ovocitario, requieren mucho tiempo y son inadecuados para obtener un número sustancial de ovocitos para el análisis14,15.
Dadas las limitaciones de los métodos existentes y los requisitos específicos de la investigación, este estudio tiene como objetivo establecer un procedimiento para separar completamente los ovocitos y las células de la granulosa y obtener un número suficiente de ovocitos limpios en estadio I para el análisis. Ampliando el método mencionado13, empleamos un tampón de digestión mejorado (ver Tabla de Materiales) que es más suave y facilita la dispersión de los ovocitos y la disociación de las células de la granulosa. Posteriormente, los ovocitos pasan a través de un filtro celular, seguido de un lavado y una posterior selección microscópica, lo que permite la adquisición de un gran número de ovocitos limpios en estadio I.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este estudio, desarrollamos un método para aislar ovocitos puros y limpios en estadio I, excluyendo las células de la granulosa, para su análisis posterior (en particular, análisis genómicos). Comparando este método modificado con el método referenciado13, los ovocitos en estadio I obtenidos mediante este método están morfológicamente intactos, en número suficiente y libres de contaminación con otras células somáticas, lo que los hace adecuados pa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32170813 y 31871449) y el Departamento de Ciencia y Tecnología de Sichuan (2024NSFSC0651), y el proyecto 1·3·5 para disciplinas de excelencia–Fondo de Investigación Clínica, Hospital de China Occidental, Universidad de Sichuan (2024HXFH035). Los autores desean agradecer a Zhao Wang y Yanqiu Gao del Laboratorio de Cirugía Pediátrica por la cría de peces cebra en relación con este trabajo. Los autores también desean agradecer a todos los revisores que participaron en la revisión, así como a MJEditor (www.mjeditor.com) por proporcionar servicios de edición en inglés durante la preparación de este manuscrito.
Materials
| Kinger's cell dissociation solution | PlantChemMed | PC-33689 | Kinger's cell dissociation solution can be stored stably at -20 °C after packaging and can be used after thawing at low temperature (4 °C). It can be used directly for dissociating zebrafish ovaries. The optimal temperature is 28.5 °C, for approximately 2-3 hours. The duration can be adjusted according to the specific dissociation conditions, either shortened or extended (https://www.plantchemmed.com/chanpin?productNo=PC-33689). |
| Cell strainers (100 μm ) | Falcon | 352360 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
| Forceps | Dumont | #5 | |
| Glass capillary needle | / | / | Blunted by burning with lighter |
| Hoechst | Yesen | 40732ES03 | |
| Low adsorption pipette tips (10 μl ) | Labsellect | T-0010-LR-R-S | |
| Leibovitz’s L-15 medium medium (with L-glutamine) | Hyclone | SH30525.01 | |
| Ice bucket | / | / | Ice-cold water is used to euthanize zebrafish |
| Incubator | WIGGENS | WH-01 | |
| Juvenile fish | / | / | 5–6 weeks post-fertilization, standard length [SL] of 10–15 mm |
| Plastic dish (35 mm ) | SORFA | 230101 | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-161 | |
| Tissue Culture Plate (6-wells) | SORFA | 0110006 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Toosl | #15000-00 |
References
- Qin, J. Y., et al. Unraveling the mechanism of long-term bisphenol S exposure disrupted ovarian lipids metabolism, oocytes maturation, and offspring development of zebrafish. Chemosphere. 277, 130304 (2021).
- Hau, H. T. A., et al. Maternal Larp6 controls oocyte development, chorion formation and elevation. Development. 147 (4), 187385 (2020).
- Cabrera-Quio, L. E., Schleiffer, A., Mechtler, K., Pauli, A. Zebrafish ski7 tunes RNA levels during the oocyte-to-embryo transition. PLoS Genet. 17 (2), e1009390 (2021).
- Liu, Y., et al. Single-cell transcriptome reveals insights into the development and function of the zebrafish ovary. Elife. 11, 76014 (2022).
- Li, C. W., Ge, W. Spatiotemporal expression of bone morphogenetic protein family ligands and receptors in the zebrafish ovary: A potential paracrine-signaling mechanism for oocyte-follicle cell communication. Biol Reprod. 85 (5), 977-986 (2011).
- Zampolla, T., Spikings, E., Rawson, D., Zhang, T. Cytoskeleton proteins F-actin and tubulin distribution and interaction with mitochondria in the granulosa cells surrounding stage III zebrafish (Danio rerio) oocytes. Theriogenology. 76 (6), 1110-1119 (2011).
- Lubzens, E., Young, G., Bobe, J., Cerda, J. Oogenesis in teleosts: How eggs are formed. Gen Comp Endocrinol. 165 (3), 367-389 (2010).
- Song, Y., Hu, W., Ge, W. Establishment of transgenic zebrafish (Danio rerio) models expressing fluorescence proteins in the oocytes and somatic supporting cells. Gen Comp Endocrinol. 314, 113907 (2021).
- Sousa, M. L., et al. Reproductive hormones affect follicular cells and ooplasm of stage I and II oocytes in zebrafish. Reprod Fertil Dev. 28 (12), 1945-1952 (2016).
- Yan, Y. L., et al. Gonadal soma controls ovarian follicle proliferation through Gsdf in zebrafish. Dev Dyn. 246 (11), 925-945 (2017).
- Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio. J Morphol. 218 (2), 203-224 (1993).
- Wallace, R. A., Selman, K. Ultrastructural aspects of oogenesis and oocyte growth in fish and amphibians. J Electron Microsc Tech. 16 (3), 175-201 (1990).
- Elkouby, Y. M., Mullins, M. C. Methods for the analysis of early oogenesis in zebrafish. Dev Biol. 430 (2), 310-324 (2017).
- Ai, N., Liu, L., Lau, E. S., Tse, A. C., Ge, W. Separation of oocyte and follicle layer for gene expression analysis in zebrafish. Methods Mol Biol. 2218, 1-9 (2021).
- Zhan, C., et al. Explorations of the optimal method for isolating oocytes from zebrafish (Danio rerio) ovary. J Exp Zool B Mol Dev Evol. 330 (8), 417-426 (2018).
- Avma guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. Avma Available from: https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals (2020)
- Phs policy on humane care and use of laboratory animals. Olaw Available from: https://olaw.nih.gov/policies-laws/phs-policy.htm#Introduction (2015)
- Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR J. 53 (2), 192-204 (2012).
