Schnelle Isolierung von Eizellen im Stadium I bei Zebrafischen ohne Granulosazellen

Der Zebrafisch gehört zu den wichtigsten Modellsystemen der Entwicklungsbiologie. In den letzten Jahren wurde der Zebrafisch in zahlreichen Studien als Modell genutzt, um wichtige biologische Ereignisse und Regulationsprozesse von der Eizelle bis zum Embryo zu untersuchen. Diese umfassen die komplexen Prozesse der Entwicklung und Reifung von Eizellen¹, die Funktionalität mütterlicher Gene², die Regulation von mütterlich-zygotischen Übergängen³ und umfangreiche Omics-Analysen⁴.

Granulosazellen, die somatischen Zellen, die die sich entwickelnde Eizelle im Eierstockfollikel umhüllen und nähren ^5,6, spielen eine zentrale Rolle in diesem Entwicklungsprozess. Wenn sich primordiale Keimzellen (PGCs) zu Oogonien entwickeln, werden sie von einer Monoschicht aus Granulosazellen umgeben⁷. Zusammen mit den äußeren Thekalzellen bilden die Eizelle und die sie umgebenden Granulosazellen einen reifen Follikel⁸. Angesichts der grundlegenden Unterscheidung zwischen Keimzellen und Körperzellen ist die Gewinnung einer reinen Eizellprobe insbesondere für genombezogene Analysen zwingend erforderlich.

Innerhalb der Follikelstruktur des Zebrafisches weisen Granulosazellen typischerweise einen Durchmesser von nur wenigen Mikrometern^{auf 8}, was die enge Verbindung zwischen Granulosazellen und Eizellen unterstreicht⁹. Diese enge Assoziation stellt eine Herausforderung dar, um eine vollständige Trennung zu erreichen, da sich sowohl die Anzahl als auch das Volumen von Granulosazellen und Eizellen (Hunderte von Granulosazellen im Vergleich zu einer einzelnen Eizelle) erheblich ^{unterscheiden10,11}. Selbst eine minimale Kontamination mit einer einzigen Granulosazelle kann nachgelagerte Analysen, die speziell auf Eizellen abzielen, erschweren. Daher ist für Studien, die sich auf genomische und epigenetische Merkmale konzentrieren, die Eliminierung von Granulosazellen unerlässlich.

Ausgehend von gut charakterisierten morphologischen Kriterien können die Eizellen in jedem Stadium anhand des Durchmessers¹¹ unterschieden werden. Der Oogeneseprozess im Zebrafisch wird nach Morphologie und Karyotyp¹¹ in fünf Stadien eingeteilt. Eizellen im Stadium I (7-140 μm Durchmesser) umfassen Eizellen vom Beginn der Meiose bis zum frühen Stadium der Meiose I. Entscheidend ist, dass diese Eizellen transparent sind, was die Beobachtung des zentralen Kerns durch Durchlicht ermöglicht (Abbildung 1Ai). Eizellen im Stadium II (140-340 μm Durchmesser) werden allmählich schaumig und durchscheinend. Mit der Vergrößerung der Follikel und der Proliferation der kortikalen Alveolen werden die keimförmigen Vesikel in der Mitte schwer zu unterscheiden¹² (Abbildung 1Aii). Eizellen im Stadium III (340-690 μm Durchmesser) akkumulieren nach und nach Vitellogenin, und frische Follikel werden zunehmend undurchsichtig (Abbildung 1Aiii). Die Meiose setzt sich in Eizellen im Stadium IV (690-730 μm Durchmesser) fort, wenn die Chromosomen in die Mitte der Meiose II eintreten, wo sie stagnieren (Abbildung 1Aiv). Eizellen im Stadium V (730-750 μm Durchmesser) sind gereift und bereit für den Eisprung ^7,11 (Abbildung 1Av).

Basierend auf den einzigartigen Merkmalen jedes der oben genannten Stadien wurde ein Verfahren zur Isolierung von Eizellen der Stadien I bis III vorgeschlagen, indem die Eierstöcke des Zebrafisches unter Verwendung einer Verdauungslösung, die Kollagenase I, Kollagenase II und Hyaluronidase enthält, verdaut werden, gefolgt von einer Filtration durch ein Zellsieb bestimmter Größe¹³. Diese Methode ermöglicht zwar die Gewinnung von Eizellen in verschiedenen Entwicklungsstadien, aber es gelingt nicht, Eizellen und Granulosazellen vollständig zu trennen. Andere Forscher haben auch Methoden vorgeschlagen, um Granulosazellen von Eizellen zu trennen. Diese Methoden beruhen jedoch in erster Linie auf mechanischen Ansätzen, die zu Eizellschäden führen können, zeitaufwändig sind und nicht ausreichen, um eine beträchtliche Anzahl von Eizellen für die Analyse zu gewinnen ^14,15.

Angesichts der Einschränkungen bestehender Methoden und spezifischer Forschungsanforderungen zielt diese Studie darauf ab, ein Verfahren zu etablieren, um Eizellen und Granulosazellen gründlich zu trennen und eine ausreichende Anzahl sauberer Eizellen im Stadium I für die Analyse zu erhalten. In Erweiterung der referenzierten Methode¹³ verwenden wir einen verbesserten Verdauungspuffer (siehe Materialtabelle), der schonender ist und die Dispergierung von Eizellen und die Dissoziation von Granulosazellen erleichtert. Anschließend werden die Eizellen durch ein Zellsieb geleitet, gefolgt von einer Reinigung und weiteren mikroskopischen Selektion, die die Gewinnung einer großen Anzahl sauberer Eizellen im Stadium I ermöglicht.