Aislamiento rápido de ovocitos en estadio I en pez cebra desprovistos de células granulosas

Todos los peces cebra se manipularon siguiendo estrictas pautas de cuidado animal descritas por los organismos nacionales y/o locales de bienestar animal pertinentes. El mantenimiento y la manipulación de los peces recibieron la aprobación tanto de las autoridades locales como del comité de ética animal del Hospital de China Occidental de la Universidad de Sichuan (aprobación Nº 20220422003). Los ovarios del pez cebra contienen una mezcla de ovocitos de múltiples etapas, y cada etapa de desarrollo está presente en los ovarios del pez cebra adultos. Sin embargo, se seleccionaron peces cebra juveniles para este estudio debido a la dominancia de ovocitos en etapa tardía (etapa II-III) en los ovarios de peces adultos, que son grandes y opacos. Por el contrario, los juveniles tienen ovarios planos y alargados que consisten principalmente en ovocitos en estadio I (Figura 1B) (Figura 1B). Investigaciones previas han demostrado que las características morfológicas de la ovogénesis temprana en el pez cebra adulto y juvenil son altamente consistentes, lo que respalda la factibilidad de utilizar peces cebra juveniles13. Los procedimientos que se describen a continuación, descritos en la Figura 2, proporcionan una descripción detallada del proceso de aislamiento, desde la disección hasta la obtención de ovocitos limpios en estadio I. Para mayor referencia, los reactivos, tampones y equipos utilizados en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales. 1. Disección de ovarios Seleccione varias hembras de pez cebra con una longitud estándar (SL) que oscile entre 10 mm y 15 mm.NOTA: El SL, medido desde el hocico hasta la base de la cola en milímetros, sirve como un criterio confiable para seleccionar los peces apropiados. Se recomienda utilizar peces juveniles entre 5 y 7 semanas después de la fertilización (wpf) con un SL que oscila entre 10 mm y 15 mm para este procedimiento. Los ovarios de los peces cebra juveniles están ocupados predominantemente por ovocitos tempranos, lo que proporciona condiciones óptimas para la obtención fácil de ovocitos en estadio I (Figura 1B). Eutanasiar a las hembras juveniles colocándolas en agua helada (0-4 °C).NOTA: Se deben llevar a cabo los siguientes procedimientos para garantizar la eutanasia y minimizar el dolor experimentado por el pez cebra durante la eutanasia: confirmar que la temperatura del agua helada está dentro del rango de 0-4 °C con un termómetro, transferir rápidamente el pez cebra al agua helada y mantenerlo en el agua helada durante al menos 10 minutos después del cese del movimiento opercular16, Isaías 17,18. Seque el exceso de agua en la superficie del pez con papel absorbente. Disecciona el pez cebra bajo un microscopio estereoscópico siguiendo estos pasos:Cortar la cabeza con microtijeras a lo largo del margen posterior de la cubierta branquial; Corta la cola a lo largo de la cloaca. Transfiera el tronco central a un plato de 35 mm que contenga 2 mL de medio L-15 (con L-glutamina). Disecciona el tronco medio en el medio L-15. Cortar a lo largo del eje central del abdomen y extraer las vísceras y la vejiga natatoria.NOTA: Las vísceras del pez cebra están conectadas. Por lo tanto, pellizque el intestino posterior cerca de la región anal y levántelo para eliminar fácilmente toda la masa visceral. Separe los ovarios bilaterales del abdomen con pinzas. Extraer el tejido adiposo, las escamas y otros tejidos corporales adheridos al ovario.NOTA: Los ovarios están cubiertos de tejido adiposo. Por lo tanto, lo mejor es eliminarlos juntos para evitar daños mecánicos en los ovocitos.PRECAUCIÓN: Manipule las pinzas con cuidado para evitar lesiones. 2. Digestión Transfiera los ovarios a una placa de 6 pocillos que contenga 2 mL de solución de disociación celular de Kinger e incube durante 2-3 h a 28,5 °C. Agite la placa de 6 pocillos cada 30 minutos para promover la dispersión.NOTA: Use pinzas para separar los ovarios en pequeños bloques de tejido para mejorar la eficacia de la digestión. El tiempo de digestión es variable; Monitorizar y finalizar regularmente el proceso cuando un número significativo de ovocitos en estadio I se encuentran dispersos bajo el microscopio estereoscópico. La solución de disociación celular de Kinger es la solución de trabajo y se puede utilizar directamente. Puede almacenarse de forma estable a -20 °C después del envasado y descongelarse a baja temperatura (4 °C) antes de su uso. Añadir medio L-15 precalentado a 28,5 °C al tampón de digestión para detener la digestión. 3. Filtración Coloque un colador de células de 100 μm en otro pocillo de la placa de 6 pocillos, agregue medio L-15 y asegúrese de que el nivel del medio sea más alto que el filtro.NOTA: El diámetro teórico de los ovocitos en estadio I es inferior a 140 μm. Sin embargo, los ovocitos con diámetros más grandes aún pueden pasar a través del filtro celular. Por lo tanto, en este paso se seleccionó un filtro de células con un diámetro menor que el objetivo. Los tamaños de malla se pueden ajustar en función de las necesidades experimentales específicas. Extrae el medio digestivo a través del colador de células con una pipeta. Espere 1-2 minutos hasta que todos los ovocitos de la etapa I hayan pasado a través del filtro, luego retírelo. Asegúrese de que los ovocitos permanezcan en el líquido durante todo el proceso de transferencia.NOTA: Mantener los ovocitos en el medio ayuda a mantener su integridad y condición óptima. Si los ovocitos se exponen al aire durante un período prolongado, podrían secarse y dañarse, afectando la eficiencia de la separación final. Mantenga la pipeta por debajo de la superficie líquida cuando transfiera los ovocitos a través del filtro celular en lugar de agregarlos de manera suspendida. 4. Lavado Retire el exceso de medio con una pipeta. Añadir 4 mL de medio L-15 fresco y resuspender suavemente los ovocitos. Espere de 1 a 2 minutos, luego retire el sobrenadante.NOTA: Utilice instrumentos con propiedades de baja adherencia para evitar daños en los ovocitos. Repita el paso 4.1 5-6 veces hasta que no haya otras impurezas presentes.NOTA: La manipulación suave durante el proceso de lavado es crucial para evitar daños en los ovocitos. A pesar de obtener una abundancia de ovocitos en estadio I (aproximadamente 200-400 ovocitos en estadio I de un pez cebra) después de los pasos de lavado anteriores, los ovocitos aún pueden mezclarse con fragmentos de células, ovocitos de otros estadios o pequeños gránulos formados por ovocitos rotos en etapa tardía. Además, algunas células de la granulosa aún pueden adherirse a la superficie de varios ovocitos debido a una digestión enzimática incompleta. Por lo tanto, para aplicaciones que exigen un mayor nivel de pureza, como la secuenciación del genoma, son necesarios pasos adicionales para seleccionar ovocitos completamente limpios. Para solucionar este problema, continúe con los pasos 5 y 6. 5. Selección para el control de calidad Transfiera los ovocitos lavados en estadio I a una placa de 35 mm que contenga medio L-15 fresco. Bajo un microscopio con un aumento igual o superior a 10x, extraiga fragmentos de células, ovocitos en otras etapas y ovocitos en etapa I adheridos por células de la granulosa utilizando una herramienta que se pueda manipular con precisión, como una aguja de inyección roma.NOTA: Este paso requiere paciencia por parte del experimentador, pero asegura el aislamiento de ovocitos limpios e intactos.PRECAUCIÓN: Manipule las agujas de inyección con cuidado para evitar lesiones. 6. Confirmación por tinción nuclear NOTA: Para un mayor refinamiento de los ovocitos aislados, se empleó la tinción con Hoechst 33342 para identificar y eliminar ovocitos individuales adheridos con células de la granulosa que pueden haber pasado desapercibidos en el paso anterior. Añadir una concentración final de 5 μg/mL de Hoechst 33342 al medio L-15 e incubar a temperatura ambiente durante 10 min. Observe la fluorescencia de Hoechst a través de un microscopio de fluorescencia bajo excitación láser UV.NOTA: Hoechst se excita típicamente en la región ultravioleta, generalmente en longitudes de onda entre 310 y 360 nm. Se recomienda utilizar un aumento entre 80x y 100x durante este proceso. Emplea el modo de exposición automática. La longitud de onda de excitación y el tiempo de exposición se pueden ajustar en función del modelo de microscopio específico y de los requisitos individuales. Con una aguja, seleccione cuidadosamente los ovocitos que no cumplan con los criterios deseados.NOTA: Al visualizar las células, una gran cromatina nuclear está presente en el centro del ovocito. Si las células de la granulosa estuvieran adheridas al ovocito, se verían núcleos pequeños y brillantes, aferrados al borde del ovocito (Figura 3). Esquínalos bajo el microscopio. Lavar a fondo y repetidamente los ovocitos con L-15 para eliminar el exceso de Hoechst. Utilice los ovocitos identificados en estadio I directamente para su posterior extracción o almacénelos a -80 °C después de la congelación instantánea en nitrógeno líquido.PRECAUCIÓN: Use una mascarilla protectora y guantes criogénicos cuando manipule nitrógeno líquido y congeladores de temperatura ultrabaja.