Isolamento rápido de oócitos estágio I em peixe-zebra desprovido de células da granulosa
Summary
Este protocolo descreve um procedimento modificado para isolar rapidamente oócitos limpos em estágio I em peixe-zebra desprovido de células da granulosa, fornecendo assim um método conveniente para pesquisa específica de oócitos.
Abstract
O estudo do desenvolvimento do oócito tem implicações significativas na biologia do desenvolvimento. O peixe-zebra (Danio rerio) tem sido amplamente utilizado como organismo modelo para investigar processos iniciais de desenvolvimento do oócito ao embrião. No peixe-zebra, os oócitos são circundados por uma única camada de células somáticas da granulosa. No entanto, separar as células da granulosa dos oócitos representa um desafio, pois obter oócitos puros é crucial para uma análise precisa. Embora vários métodos tenham sido propostos para isolar oócitos de peixe-zebra em diferentes estágios de desenvolvimento, as técnicas atuais são insuficientes na remoção completa das células da granulosa, limitando a precisão da análise do genoma focada apenas em oócitos. Neste estudo, desenvolvemos com sucesso um processo rápido e eficiente para isolar oócitos puros em estágio I em peixe-zebra, eliminando a contaminação das células da granulosa. Esta técnica facilita a análise bioquímica e molecular, particularmente na exploração de aspectos epigenéticos e de estrutura genômica específicos dos oócitos. Notavelmente, o método é fácil de usar, minimiza os danos aos oócitos e fornece uma solução prática para pesquisas e análises subsequentes.
Introduction
O peixe-zebra está entre os sistemas modelo mais importantes na biologia do desenvolvimento. Nos últimos anos, vários estudos utilizaram o peixe-zebra como modelo para estudar eventos biológicos importantes e processos regulatórios do oócito ao embrião. Estes abrangem os intrincados processos de desenvolvimento e maturação do oócito1, a funcionalidade dos genes maternos2, a regulação das transições materno-zigóticas3 e extensas análises ômicas4.
As células da granulosa, as células somáticas que envolvem e nutrem o oócito em desenvolvimento dentro do folículo ovariano 5,6, desempenham um papel fundamental nesse processo de desenvolvimento. À medida que as células germinativas primordiais (PGCs) evoluem para oogônias, elas se tornam cercadas por uma monocamada de células da granulosa7. Juntamente com as células tecais externas, o oócito e as células da granulosa circundantes constituem um folículo maduro8. Dada a distinção fundamental entre células germinativas e células somáticas, a obtenção de uma amostra de oócito puro é imperativa, especialmente para análises relacionadas ao genoma.
Dentro da estrutura folicular do peixe-zebra, as células da granulosa normalmente exibem um diâmetro de apenas alguns mícrons8, enfatizando a interconexão íntima entre as células da granulosa e os oócitos9. Essa estreita associação representa um desafio para alcançar a separação completa devido à diferença considerável no número e volume de células da granulosa versus oócitos (centenas de células da granulosa em comparação com um único oócito)10,11. Mesmo a contaminação mínima com uma única célula da granulosa pode impedir as análises a jusante direcionadas especificamente aos oócitos. Portanto, para estudos com foco em características genômicas e epigenéticas, a eliminação das células da granulosa é essencial.
Beneficiando-se de critérios morfológicos bem caracterizados, os oócitos em cada estágio podem ser distinguidos com base no diâmetro11. O processo de oogênese no peixe-zebra é categorizado em cinco estágios de acordo com a morfologia e cariótipo11. Os oócitos do estágio I (7-140 μm de diâmetro) abrangem oócitos desde o início da meiose até o estágio inicial da meiose I. Crucialmente, esses oócitos são transparentes, permitindo a observação do núcleo central através da luz transmitida (Figura 1Ai). Os oócitos do estágio II (140-340 μm de diâmetro) tornam-se gradualmente espumosos e translúcidos. Com o aumento dos folículos e a proliferação de alvéolos corticais, as vesículas germinativas no centro tornam-se difíceis de distinguir12 (Figura 1Aii). Os oócitos em estágio III (340-690 μm de diâmetro) acumulam progressivamente vitelogenina e os folículos frescos tornam-se cada vez mais opacos (Figura 1Aiii). A meiose continua nos oócitos do estágio IV (690-730 μm de diâmetro) à medida que os cromossomos entram no meio da meiose II, onde estagnam (Figura 1Aiv). Os oócitos em estágio V (730-750 μm de diâmetro) amadureceram e estão prontos para a ovulação 7,11 (Figura 1Av).
Com base nas características únicas de cada um dos estágios acima mencionados, foi proposto um método para isolar oócitos dos estágios I a III digerindo ovários de peixe-zebra usando uma solução digestiva contendo colagenase I, colagenase II e hialuronidase, seguida de filtração através de um filtro de células de tamanho específico13. No entanto, embora esse método permita a obtenção de oócitos em diferentes estágios de desenvolvimento, ele não consegue separar completamente os oócitos e as células da granulosa. Outros pesquisadores também sugeriram métodos para separar as células da granulosa dos oócitos. No entanto, esses métodos dependem principalmente de abordagens mecânicas, que podem causar danos aos oócitos, são demorados e inadequados para a obtenção de um número substancial de oócitos para análise14,15.
Dadas as limitações dos métodos existentes e os requisitos específicos de pesquisa, este estudo tem como objetivo estabelecer um procedimento para separar completamente oócitos e células da granulosa e obter um número suficiente de oócitos limpos em estágio I para análise. Expandindo o método referenciado13, empregamos um tampão de digestão aprimorado (ver Tabela de Materiais) que é mais suave e facilita a dispersão de oócitos e a dissociação das células da granulosa. Posteriormente, os oócitos são passados por um filtro de células, seguido de lavagem e posterior seleção microscópica, permitindo a aquisição de um grande número de oócitos limpos em estágio I.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste estudo, desenvolvemos um método para isolar oócitos puros e limpos em estágio I, excluindo células da granulosa, para análise a jusante (particularmente análises genômicas). Comparando este método modificado com o método referenciado13, os oócitos do estádio I obtidos com este método estão morfologicamente intactos, em número suficiente e livres de contaminação com outras células somáticas, tornando-os adequados para vários estudos e anál…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32170813 e 31871449) e pelo Departamento de Ciência e Tecnologia de Sichuan (2024NSFSC0651), e pelo projeto 1·3·5 para disciplinas de excelência – Fundo de Pesquisa Clínica, Hospital da China Ocidental, Universidade de Sichuan (2024HXFH035). Os autores gostariam de agradecer a Zhao Wang e Yanqiu Gao, do Laboratório de Cirurgia Pediátrica, pela criação de peixes-zebra relacionados a este trabalho. Os autores também gostariam de agradecer a todos os revisores que participaram da revisão, bem como ao MJEditor (www.mjeditor.com) por fornecer serviços de edição em inglês durante a preparação deste manuscrito.
Materials
| Kinger's cell dissociation solution | PlantChemMed | PC-33689 | Kinger's cell dissociation solution can be stored stably at -20 °C after packaging and can be used after thawing at low temperature (4 °C). It can be used directly for dissociating zebrafish ovaries. The optimal temperature is 28.5 °C, for approximately 2-3 hours. The duration can be adjusted according to the specific dissociation conditions, either shortened or extended (https://www.plantchemmed.com/chanpin?productNo=PC-33689). |
| Cell strainers (100 μm ) | Falcon | 352360 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
| Forceps | Dumont | #5 | |
| Glass capillary needle | / | / | Blunted by burning with lighter |
| Hoechst | Yesen | 40732ES03 | |
| Low adsorption pipette tips (10 μl ) | Labsellect | T-0010-LR-R-S | |
| Leibovitz’s L-15 medium medium (with L-glutamine) | Hyclone | SH30525.01 | |
| Ice bucket | / | / | Ice-cold water is used to euthanize zebrafish |
| Incubator | WIGGENS | WH-01 | |
| Juvenile fish | / | / | 5–6 weeks post-fertilization, standard length [SL] of 10–15 mm |
| Plastic dish (35 mm ) | SORFA | 230101 | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-161 | |
| Tissue Culture Plate (6-wells) | SORFA | 0110006 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Toosl | #15000-00 |
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