Быстрое выделение ооцитов I стадии у рыбок данио-рерио, лишенных гранулезных клеток
Summary
Этот протокол описывает модифицированную процедуру быстрого выделения чистых ооцитов стадии I у рыбок данио, лишенных гранулезных клеток, тем самым обеспечивая удобный метод для исследования, специфичного для ооцитов.
Abstract
Изучение развития ооцитов имеет важное значение для биологии развития. Данио рерио (Danio rerio) широко использовалась в качестве модельного организма для исследования ранних процессов развития от ооцита до эмбриона. У рыбок данио ооциты окружены одним слоем соматических гранулезных клеток. Тем не менее, отделение гранулезных клеток от ооцитов представляет собой сложную задачу, поскольку получение чистых ооцитов имеет решающее значение для точного анализа. Несмотря на то, что были предложены различные методы выделения ооцитов данио-рерио на разных стадиях развития, современные методы не позволяют полностью удалить гранулезные клетки, что ограничивает точность анализа генома, сосредоточенного исключительно на ооцитах. В этом исследовании мы успешно разработали быстрый и эффективный процесс выделения чистых ооцитов I стадии у рыбок данио-рерио с одновременным устранением загрязнения гранулезных клеток. Этот метод облегчает биохимический и молекулярный анализ, особенно при изучении эпигенетических аспектов и структуры генома, специфичных для ооцитов. Примечательно, что метод удобен в использовании, сводит к минимуму повреждение ооцитов и обеспечивает практическое решение для последующих исследований и анализов.
Introduction
Рыбки данио рерио являются одной из наиболее важных модельных систем в биологии развития. В последние годы в многочисленных исследованиях рыбки данио использовались в качестве модели для изучения важных биологических событий и регуляторных процессов от ооцита до эмбриона. Они охватывают сложные процессы развития исозревания ооцитов1, функциональность материнскихгенов2, регуляцию материнско-зиготическихпереходов3, а также обширный омиксныйанализ4.
Гранулезные клетки, соматические клетки, обволакивающие и питающие развивающийся ооцит в фолликуле яичника 5,6, играют ключевую роль в этом процессе развития. По мере того, как первичные половые клетки (ПГК) эволюционируют в оогонию, они оказываются окружены монослоем гранулезных клеток7. Вместе с внешними текальными клетками ооцит и окружающие его гранулезные клетки образуют зрелый фолликул8. Учитывая фундаментальное различие между половыми клетками и соматическими клетками, получение чистого образца ооцитов является обязательным условием, особенно для анализов, связанных с геномом.
В фолликулярной структуре рыбок данио гранулеза обычно имеют диаметр всего внесколько микрон8, что подчеркивает тесную взаимосвязь между гранулезными клетками и ооцитами9. Эта тесная связь представляет собой проблему для достижения полного разделения из-за значительной разницы как в количестве, так и в объеме гранулезных клеток по сравнению с ооцитами (сотни гранулезных клеток по сравнению с одним ооцитом)10,11. Даже минимальное загрязнение одной гранулезной клеткой может препятствовать последующему анализу, специально нацеленному на ооциты. Поэтому для исследований, посвященных геномным и эпигенетическим характеристикам, элиминация гранулезных клеток имеет важное значение.
Благодаря хорошо охарактеризованным морфологическим критериям ооциты на каждой стадии могут быть различимы на основе диаметра11. Процесс оогенеза у рыбок данио делится на пять стадий в соответствии с морфологией и кариотипом11. Ооциты I стадии (диаметр 7-140 мкм) охватывают ооциты с начала мейоза до ранней стадии мейоза I. Важно отметить, что эти ооциты прозрачны, что позволяет наблюдать центральное ядро через проходящий свет (рис. 1Ai). Ооциты II стадии (диаметр 140-340 мкм) постепенно становятся пенистыми и полупрозрачными. При увеличении фолликулов и разрастании кортикальных альвеол зародышевые пузырьки в центре становится трудно различить12 (рисунок 1Aii). Ооциты III стадии (диаметр 340-690 мкм) постепенно накапливают вителлогенин, и свежие фолликулы становятся все более непрозрачными (рисунок 1Aiii). Мейоз продолжается в ооцитах IV стадии (690-730 мкм в диаметре), поскольку хромосомы входят в середину мейоза II, где они застаиваются (Рисунок 1Aiv). Ооциты стадии V (диаметр 730-750 мкм) созрели и готовы к овуляции 7,11 (рис. 1Av).
Основываясь на уникальных характеристиках каждой из вышеупомянутых стадий, был предложен способ выделения ооцитов от стадий I до III путем переваривания яичников данио рерио с использованием пищеварительного раствора, содержащего коллагеназу I, коллагеназу II и гиалуронидазу, с последующей фильтрацией через клеточное сетчатое фильтр определенного размера13. Однако, несмотря на то, что этот метод позволяет получить ооциты на разных стадиях развития, он не позволяет полностью разделить ооциты и гранулезные клетки. Другие исследователи также предложили методы отделения гранулезных клеток от ооцитов. Тем не менее, эти методы в первую очередь основаны на механических подходах, которые могут привести к повреждению ооцитов, требуют много времени и недостаточны для получения значительного количества ооцитов для анализа14,15.
Учитывая ограничения существующих методов и специфические требования к исследованиям, данное исследование направлено на установление процедуры тщательного разделения ооцитов и гранулезных клеток и получение достаточного количества чистых ооцитов I стадии для анализа. Развивая упомянутый способ13, мы используем улучшенный буфер для пищеварения (см. Таблицу материалов), который является более щадящим и способствует диспергированию ооцитов и диссоциации гранулезных клеток. Затем ооциты пропускают через клеточное сетчатое фильтр, после чего проводят промывку и дальнейший микроскопический отбор, что позволяет получить большое количество чистых ооцитов I стадии.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом исследовании мы разработали метод выделения чистых и чистых ооцитов I стадии, за исключением гранулезных клеток, для последующего анализа (в частности, геномного анализа). Сравнивая этот модифицированный метод с упомянутым методом13, можно отметить…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (32170813 и 31871449) и Департаментом науки и технологий провинции Сычуань (2024NSFSC0651), а также проектом 1·3·5 для дисциплин передового опыта – Фондом клинических исследований, Западно-Китайская больница, Сычуаньский университет (2024HXFH035). Авторы хотели бы поблагодарить Чжао Вана и Яньцю Гао из лаборатории детской хирургии за разведение рыбок данио, связанных с этой работой. Авторы также хотели бы поблагодарить всех рецензентов, принимавших участие в рецензировании, а также MJEditor (www.mjeditor.com) за предоставление услуг по редактированию на английском языке во время подготовки данной рукописи.
Materials
| Kinger's cell dissociation solution | PlantChemMed | PC-33689 | Kinger's cell dissociation solution can be stored stably at -20 °C after packaging and can be used after thawing at low temperature (4 °C). It can be used directly for dissociating zebrafish ovaries. The optimal temperature is 28.5 °C, for approximately 2-3 hours. The duration can be adjusted according to the specific dissociation conditions, either shortened or extended (https://www.plantchemmed.com/chanpin?productNo=PC-33689). |
| Cell strainers (100 μm ) | Falcon | 352360 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
| Forceps | Dumont | #5 | |
| Glass capillary needle | / | / | Blunted by burning with lighter |
| Hoechst | Yesen | 40732ES03 | |
| Low adsorption pipette tips (10 μl ) | Labsellect | T-0010-LR-R-S | |
| Leibovitz’s L-15 medium medium (with L-glutamine) | Hyclone | SH30525.01 | |
| Ice bucket | / | / | Ice-cold water is used to euthanize zebrafish |
| Incubator | WIGGENS | WH-01 | |
| Juvenile fish | / | / | 5–6 weeks post-fertilization, standard length [SL] of 10–15 mm |
| Plastic dish (35 mm ) | SORFA | 230101 | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-161 | |
| Tissue Culture Plate (6-wells) | SORFA | 0110006 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Toosl | #15000-00 |
References
- Qin, J. Y., et al. Unraveling the mechanism of long-term bisphenol S exposure disrupted ovarian lipids metabolism, oocytes maturation, and offspring development of zebrafish. Chemosphere. 277, 130304 (2021).
- Hau, H. T. A., et al. Maternal Larp6 controls oocyte development, chorion formation and elevation. Development. 147 (4), 187385 (2020).
- Cabrera-Quio, L. E., Schleiffer, A., Mechtler, K., Pauli, A. Zebrafish ski7 tunes RNA levels during the oocyte-to-embryo transition. PLoS Genet. 17 (2), e1009390 (2021).
- Liu, Y., et al. Single-cell transcriptome reveals insights into the development and function of the zebrafish ovary. Elife. 11, 76014 (2022).
- Li, C. W., Ge, W. Spatiotemporal expression of bone morphogenetic protein family ligands and receptors in the zebrafish ovary: A potential paracrine-signaling mechanism for oocyte-follicle cell communication. Biol Reprod. 85 (5), 977-986 (2011).
- Zampolla, T., Spikings, E., Rawson, D., Zhang, T. Cytoskeleton proteins F-actin and tubulin distribution and interaction with mitochondria in the granulosa cells surrounding stage III zebrafish (Danio rerio) oocytes. Theriogenology. 76 (6), 1110-1119 (2011).
- Lubzens, E., Young, G., Bobe, J., Cerda, J. Oogenesis in teleosts: How eggs are formed. Gen Comp Endocrinol. 165 (3), 367-389 (2010).
- Song, Y., Hu, W., Ge, W. Establishment of transgenic zebrafish (Danio rerio) models expressing fluorescence proteins in the oocytes and somatic supporting cells. Gen Comp Endocrinol. 314, 113907 (2021).
- Sousa, M. L., et al. Reproductive hormones affect follicular cells and ooplasm of stage I and II oocytes in zebrafish. Reprod Fertil Dev. 28 (12), 1945-1952 (2016).
- Yan, Y. L., et al. Gonadal soma controls ovarian follicle proliferation through Gsdf in zebrafish. Dev Dyn. 246 (11), 925-945 (2017).
- Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio. J Morphol. 218 (2), 203-224 (1993).
- Wallace, R. A., Selman, K. Ultrastructural aspects of oogenesis and oocyte growth in fish and amphibians. J Electron Microsc Tech. 16 (3), 175-201 (1990).
- Elkouby, Y. M., Mullins, M. C. Methods for the analysis of early oogenesis in zebrafish. Dev Biol. 430 (2), 310-324 (2017).
- Ai, N., Liu, L., Lau, E. S., Tse, A. C., Ge, W. Separation of oocyte and follicle layer for gene expression analysis in zebrafish. Methods Mol Biol. 2218, 1-9 (2021).
- Zhan, C., et al. Explorations of the optimal method for isolating oocytes from zebrafish (Danio rerio) ovary. J Exp Zool B Mol Dev Evol. 330 (8), 417-426 (2018).
- Avma guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. Avma Available from: https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals (2020)
- Phs policy on humane care and use of laboratory animals. Olaw Available from: https://olaw.nih.gov/policies-laws/phs-policy.htm#Introduction (2015)
- Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR J. 53 (2), 192-204 (2012).
