Snelle isolatie van stadium I eicellen in zebravissen zonder granulosacellen
Summary
Dit protocol beschrijft een aangepaste procedure voor het snel isoleren van schone fase I-eicellen in zebravissen zonder granulosacellen, waardoor een handige methode wordt geboden voor eicelspecifiek onderzoek.
Abstract
De studie van de ontwikkeling van eicellen heeft belangrijke implicaties voor de ontwikkelingsbiologie. De zebravis (Danio rerio) is op grote schaal gebruikt als modelorganisme om vroege ontwikkelingsprocessen van eicel tot embryo te onderzoeken. Bij zebravissen zijn de eicellen omgeven door een enkele laag somatische granulosacellen. Het scheiden van granulosacellen van eicellen vormt echter een uitdaging, aangezien het verkrijgen van zuivere eicellen cruciaal is voor nauwkeurige analyse. Hoewel er verschillende methoden zijn voorgesteld om oöcyten van zebravissen in verschillende ontwikkelingsstadia te isoleren, schieten de huidige technieken tekort in het volledig verwijderen van granulosacellen, waardoor de nauwkeurigheid van genoomanalyse die uitsluitend op eicellen is gericht, wordt beperkt. In deze studie hebben we met succes een snel en efficiënt proces ontwikkeld voor het isoleren van zuivere fase I-eicellen in zebravissen en het elimineren van granulosacelcontaminatie. Deze techniek vergemakkelijkt de biochemische en moleculaire analyse, met name bij het onderzoeken van epigenetische en genoomstructuuraspecten die specifiek zijn voor eicellen. De methode is met name gebruiksvriendelijk, minimaliseert eicelschade en biedt een praktische oplossing voor verder onderzoek en analyse.
Introduction
De zebravis behoort tot de belangrijkste modelsystemen in de ontwikkelingsbiologie. In de afgelopen jaren hebben talloze studies de zebravis gebruikt als model om belangrijke biologische gebeurtenissen en regulerende processen van eicel tot embryo te bestuderen. Deze omvatten de ingewikkelde processen van de ontwikkeling en rijping van eicellen1, de functionaliteit van maternale genen2, de regulatie van maternale zygote overgangen3 en uitgebreide omics-analyses4.
Granulosacellen, de somatische cellen die de zich ontwikkelende eicel in de eierstokfollikel 5,6 omhullen en voeden, spelen een cruciale rol in dit ontwikkelingsproces. Naarmate primordiale kiemcellen (PGC’s) evolueren tot oögonen, worden ze omgeven door een monolaag van granulosacellen7. Samen met de uitwendige thecale cellen vormen de eicel en de omringende granulosacellen een rijpe follikel8. Gezien het fundamentele onderscheid tussen geslachtscellen en somatische cellen, is het verkrijgen van een zuiver eicelmonster absoluut noodzakelijk, vooral voor genoomgerelateerde analyses.
Binnen de folliculaire structuur van zebravissen vertonen granulosacellen doorgaans een diameter van slechts enkele microns8, wat de intieme onderlinge verbinding tussen granulosacellen en eicellen benadrukt9. Deze nauwe associatie vormt een uitdaging bij het bereiken van volledige scheiding vanwege het aanzienlijke verschil in zowel het aantal als het volume van granulosacellen versus eicellen (honderden granulosacellen vergeleken met een enkele eicel)10,11. Zelfs een minimale contaminatie met een enkele granulosacel kan stroomafwaartse analyses belemmeren die specifiek gericht zijn op eicellen. Daarom is voor studies die zich richten op genomische en epigenetische kenmerken de eliminatie van granulosacellen essentieel.
Profiterend van goed gekarakteriseerde morfologische criteria, kunnen eicellen in elk stadium worden onderscheiden op basis van diameter11. Het oögeneseproces in zebravissen is onderverdeeld in vijf fasen volgens morfologie en karyotype11. Stadium I-eicellen (diameter 7-140 μm) omvatten eicellen vanaf het begin van de meiose tot het vroege stadium van meiose I. Cruciaal is dat deze eicellen transparant zijn, waardoor de centrale kern kan worden waargenomen door middel van doorvallend licht (Figuur 1Ai). Stadium II-eicellen (diameter 140-340 μm) worden geleidelijk schuimig en doorschijnend. Met de vergroting van de follikels en de proliferatie van corticale longblaasjes worden de kiemblaasjes in het midden moeilijk te onderscheiden12 (Figuur 1Aii). Stadium III-eicellen (diameter 340-690 μm) accumuleren geleidelijk vitellogenine en verse follikels worden steeds ondoorzichtiger (Figuur 1Aiii). Meiose gaat verder in stadium IV oöcyten (690-730 μm diameter) terwijl chromosomen het midden van meiose II ingaan, waar ze stagneren (Figuur 1Aiv). Stadium V-eicellen (diameter 730-750 μm) zijn gerijpt en klaar voor ovulatie 7,11 (figuur 1Av).
Op basis van de unieke kenmerken van elk van de bovengenoemde stadia is een methode voorgesteld om eicellen van stadia I tot III te isoleren door de eierstokken van zebravissen te verteren met behulp van een spijsverteringsoplossing die collagenase I, collagenase II en hyaluronidase bevat, gevolgd door filtratie door een celzeef van specifieke grootte13. Hoewel deze methode het mogelijk maakt om eicellen in verschillende ontwikkelingsstadia te verkrijgen, slaagt het er niet in om eicellen en granulosacellen volledig te scheiden. Andere onderzoekers hebben ook methoden voorgesteld om granulosacellen van eicellen te scheiden. Deze methoden zijn echter voornamelijk gebaseerd op mechanische benaderingen, die eicelschade kunnen veroorzaken, tijdrovend zijn en ontoereikend zijn om een aanzienlijk aantal eicellen voor analyse te verkrijgen14,15.
Gezien de beperkingen van de bestaande methoden en specifieke onderzoeksvereisten, heeft deze studie tot doel een procedure vast te stellen om eicellen en granulosacellen grondig te scheiden en een voldoende aantal schone fase I-eicellen te verkrijgen voor analyse. Voortbouwend op de genoemde methode13, gebruiken we een verbeterde spijsverteringsbuffer (zie Materiaaltabel) die zachter is en de dispersie van eicellen en dissociatie van granulosacellen vergemakkelijkt. Vervolgens worden de eicellen door een celzeef geleid, gevolgd door wassen en verdere microscopische selectie, waardoor een groot aantal schone fase I-eicellen kan worden verkregen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In deze studie hebben we een methode ontwikkeld voor het isoleren van zuivere en schone fase I-eicellen, met uitzondering van granulosacellen, voor stroomafwaartse analyse (met name genomische analyses). Als we deze gewijzigde methode vergelijken met de methode waarnaar wordt verwezen13, zijn de met deze methode verkregen stadium I-eicellen morfologisch intact, voldoende in aantal en vrij van contaminatie met andere somatische cellen, waardoor ze geschikt zijn voo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (32170813 en 31871449) en de afdeling Wetenschap en Technologie van Sichuan (2024NSFSC0651), en het 1·3·5-project voor excellente disciplines – Clinical Research Fund, West China Hospital, Sichuan University (2024HXFH035). De auteurs willen Zhao Wang en Yanqiu Gao van het Laboratorium voor Kinderchirurgie bedanken voor het fokken van zebravissen die verband houden met dit werk. De auteurs willen ook alle recensenten bedanken die hebben deelgenomen aan de review, evenals MJEditor (www.mjeditor.com) voor het leveren van Engelse redactiediensten tijdens de voorbereiding van dit manuscript.
Materials
| Kinger's cell dissociation solution | PlantChemMed | PC-33689 | Kinger's cell dissociation solution can be stored stably at -20 °C after packaging and can be used after thawing at low temperature (4 °C). It can be used directly for dissociating zebrafish ovaries. The optimal temperature is 28.5 °C, for approximately 2-3 hours. The duration can be adjusted according to the specific dissociation conditions, either shortened or extended (https://www.plantchemmed.com/chanpin?productNo=PC-33689). |
| Cell strainers (100 μm ) | Falcon | 352360 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
| Forceps | Dumont | #5 | |
| Glass capillary needle | / | / | Blunted by burning with lighter |
| Hoechst | Yesen | 40732ES03 | |
| Low adsorption pipette tips (10 μl ) | Labsellect | T-0010-LR-R-S | |
| Leibovitz’s L-15 medium medium (with L-glutamine) | Hyclone | SH30525.01 | |
| Ice bucket | / | / | Ice-cold water is used to euthanize zebrafish |
| Incubator | WIGGENS | WH-01 | |
| Juvenile fish | / | / | 5–6 weeks post-fertilization, standard length [SL] of 10–15 mm |
| Plastic dish (35 mm ) | SORFA | 230101 | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-161 | |
| Tissue Culture Plate (6-wells) | SORFA | 0110006 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Toosl | #15000-00 |
References
- Qin, J. Y., et al. Unraveling the mechanism of long-term bisphenol S exposure disrupted ovarian lipids metabolism, oocytes maturation, and offspring development of zebrafish. Chemosphere. 277, 130304 (2021).
- Hau, H. T. A., et al. Maternal Larp6 controls oocyte development, chorion formation and elevation. Development. 147 (4), 187385 (2020).
- Cabrera-Quio, L. E., Schleiffer, A., Mechtler, K., Pauli, A. Zebrafish ski7 tunes RNA levels during the oocyte-to-embryo transition. PLoS Genet. 17 (2), e1009390 (2021).
- Liu, Y., et al. Single-cell transcriptome reveals insights into the development and function of the zebrafish ovary. Elife. 11, 76014 (2022).
- Li, C. W., Ge, W. Spatiotemporal expression of bone morphogenetic protein family ligands and receptors in the zebrafish ovary: A potential paracrine-signaling mechanism for oocyte-follicle cell communication. Biol Reprod. 85 (5), 977-986 (2011).
- Zampolla, T., Spikings, E., Rawson, D., Zhang, T. Cytoskeleton proteins F-actin and tubulin distribution and interaction with mitochondria in the granulosa cells surrounding stage III zebrafish (Danio rerio) oocytes. Theriogenology. 76 (6), 1110-1119 (2011).
- Lubzens, E., Young, G., Bobe, J., Cerda, J. Oogenesis in teleosts: How eggs are formed. Gen Comp Endocrinol. 165 (3), 367-389 (2010).
- Song, Y., Hu, W., Ge, W. Establishment of transgenic zebrafish (Danio rerio) models expressing fluorescence proteins in the oocytes and somatic supporting cells. Gen Comp Endocrinol. 314, 113907 (2021).
- Sousa, M. L., et al. Reproductive hormones affect follicular cells and ooplasm of stage I and II oocytes in zebrafish. Reprod Fertil Dev. 28 (12), 1945-1952 (2016).
- Yan, Y. L., et al. Gonadal soma controls ovarian follicle proliferation through Gsdf in zebrafish. Dev Dyn. 246 (11), 925-945 (2017).
- Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio. J Morphol. 218 (2), 203-224 (1993).
- Wallace, R. A., Selman, K. Ultrastructural aspects of oogenesis and oocyte growth in fish and amphibians. J Electron Microsc Tech. 16 (3), 175-201 (1990).
- Elkouby, Y. M., Mullins, M. C. Methods for the analysis of early oogenesis in zebrafish. Dev Biol. 430 (2), 310-324 (2017).
- Ai, N., Liu, L., Lau, E. S., Tse, A. C., Ge, W. Separation of oocyte and follicle layer for gene expression analysis in zebrafish. Methods Mol Biol. 2218, 1-9 (2021).
- Zhan, C., et al. Explorations of the optimal method for isolating oocytes from zebrafish (Danio rerio) ovary. J Exp Zool B Mol Dev Evol. 330 (8), 417-426 (2018).
- Avma guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. Avma Available from: https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals (2020)
- Phs policy on humane care and use of laboratory animals. Olaw Available from: https://olaw.nih.gov/policies-laws/phs-policy.htm#Introduction (2015)
- Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR J. 53 (2), 192-204 (2012).
