Isolamento rapido di ovociti in stadio I in zebrafish privi di cellule della granulosa
Summary
Questo protocollo descrive una procedura modificata per isolare rapidamente ovociti puliti allo stadio I in zebrafish privi di cellule della granulosa, fornendo così un metodo conveniente per la ricerca specifica per gli ovociti.
Abstract
Lo studio dello sviluppo degli ovociti ha implicazioni significative nella biologia dello sviluppo. Il pesce zebra (Danio rerio) è stato ampiamente utilizzato come organismo modello per studiare i primi processi di sviluppo dall’ovocita all’embrione. Nel pesce zebra, gli ovociti sono circondati da un singolo strato di cellule della granulosa somatica. Tuttavia, la separazione delle cellule della granulosa dagli ovociti rappresenta una sfida, poiché il raggiungimento di ovociti puri è fondamentale per un’analisi precisa. Sebbene siano stati proposti vari metodi per isolare gli ovociti di zebrafish in diversi stadi di sviluppo, le tecniche attuali non sono in grado di rimuovere completamente le cellule della granulosa, limitando l’accuratezza dell’analisi del genoma focalizzata esclusivamente sugli ovociti. In questo studio, abbiamo sviluppato con successo un processo rapido ed efficiente per isolare gli ovociti puri allo stadio I nel pesce zebra, eliminando al contempo la contaminazione cellulare della granulosa. Questa tecnica facilita l’analisi biochimica e molecolare, in particolare nell’esplorazione degli aspetti epigenetici e della struttura del genoma specifici degli ovociti. In particolare, il metodo è facile da usare, riduce al minimo il danno agli ovociti e fornisce una soluzione pratica per la ricerca e l’analisi successive.
Introduction
Il pesce zebra è tra i più importanti sistemi modello nella biologia dello sviluppo. Negli ultimi anni, numerosi studi hanno utilizzato il pesce zebra come modello per studiare importanti eventi biologici e processi regolatori dall’ovocita all’embrione. Questi comprendono gli intricati processi di sviluppo e maturazione degli ovociti1, la funzionalità dei geni materni2, la regolazione delle transizioni materno-zigotiche3 e ampie analisi omiche4.
Le cellule della granulosa, le cellule somatiche che avvolgono e nutrono l’ovocita in via di sviluppo all’interno del follicolo ovarico 5,6, svolgono un ruolo fondamentale in questo processo di sviluppo. Quando le cellule germinali primordiali (PGC) si evolvono in oogonia, vengono circondate da un monostrato di cellule della granulosa7. Insieme alle cellule tecali esterne, l’ovocita e le cellule della granulosa circostanti costituiscono un follicolo maturo8. Data la distinzione fondamentale tra cellule germinali e cellule somatiche, ottenere un campione di ovociti puri è imperativo, soprattutto per le analisi relative al genoma.
All’interno della struttura follicolare del pesce zebra, le cellule della granulosa mostrano tipicamente un diametro di soli pochi micron8, sottolineando l’intima interconnessione tra le cellule della granulosa e gli ovociti9. Questa stretta associazione rappresenta una sfida per raggiungere la completa separazione a causa della notevole differenza sia nel numero che nel volume delle cellule della granulosa rispetto agli ovociti (centinaia di cellule della granulosa rispetto a un singolo ovocita)10,11. Anche una contaminazione minima con una singola cellula della granulosa può ostacolare le analisi a valle mirate specificamente agli ovociti. Pertanto, per gli studi incentrati sulle caratteristiche genomiche ed epigenetiche, l’eliminazione delle cellule della granulosa è essenziale.
Beneficiando di criteri morfologici ben caratterizzati, gli ovociti in ogni stadio possono essere distinti in base al diametro11. Il processo di ovogenesi nel pesce zebra è classificato in cinque fasi in base alla morfologia e al cariotipo11. Gli ovociti di stadio I (7-140 μm di diametro) comprendono gli ovociti dall’inizio della meiosi allo stadio iniziale della meiosi I. Fondamentalmente, questi ovociti sono trasparenti e consentono l’osservazione del nucleo centrale attraverso la luce trasmessa (Figura 1Ai). Gli ovociti di stadio II (diametro 140-340 μm) diventano gradualmente schiumosi e traslucidi. Con l’ingrossamento dei follicoli e la proliferazione degli alveoli corticali, le vescicole germinali al centro diventano difficili da distinguere12 (Figura 1Aii). Gli ovociti allo stadio III (340-690 μm di diametro) accumulano progressivamente vitellogenina e i follicoli freschi diventano sempre più opachi (Figura 1Aiii). La meiosi continua negli ovociti allo stadio IV (690-730 μm di diametro) quando i cromosomi entrano nel mezzo della meiosi II, dove ristagnano (Figura 1Aiv). Gli ovociti dello stadio V (730-750 μm di diametro) sono maturati e sono pronti per l’ovulazione 7,11 (Figura 1Av).
Sulla base delle caratteristiche uniche di ciascuna delle fasi sopra menzionate, è stato proposto un metodo per isolare gli ovociti dagli stadi I a III digerendo le ovaie di zebrafish utilizzando una soluzione digestiva contenente collagenasi I, collagenasi II e ialuronidasi, seguita da filtrazione attraverso un colino cellulare di dimensioni specifiche13. Tuttavia, mentre questo metodo consente di ottenere ovociti in diverse fasi di sviluppo, non riesce a separare completamente gli ovociti e le cellule della granulosa. Altri ricercatori hanno anche suggerito metodi per separare le cellule della granulosa dagli ovociti. Tuttavia, questi metodi si basano principalmente su approcci meccanici, che possono causare danni agli ovociti, richiedono molto tempo e sono inadeguati per ottenere un numero sostanziale di ovociti per l’analisi 14,15.
Dati i limiti dei metodi esistenti e le specifiche esigenze di ricerca, questo studio mira a stabilire una procedura per separare completamente gli ovociti e le cellule della granulosa e ottenere un numero sufficiente di ovociti puliti di stadio I per l’analisi. Ampliando il metodo13 di riferimento, impieghiamo un tampone di digestione migliorato (vedi Tabella dei materiali) che è più delicato e facilita la dispersione degli ovociti e la dissociazione delle cellule della granulosa. Successivamente, gli ovociti vengono fatti passare attraverso un colino cellulare, seguito da un lavaggio e da un’ulteriore selezione microscopica, consentendo l’acquisizione di un gran numero di ovociti puliti allo stadio I.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo studio, abbiamo sviluppato un metodo per isolare ovociti puri e puliti allo stadio I, escluse le cellule della granulosa, per l’analisi a valle (in particolare le analisi genomiche). Confrontando questo metodo modificato con il metodo di riferimento13, gli ovociti dello stadio I ottenuti con questo metodo sono morfologicamente intatti, in numero sufficiente e privi di contaminazione con altre cellule somatiche, il che li rende adatti per vari studi e ana…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (32170813 e 31871449) e dal Dipartimento di Scienza e Tecnologia del Sichuan (2024NSFSC0651) e dal progetto 1·3·5 per discipline di eccellenza–Clinical Research Fund, West China Hospital, Sichuan University (2024HXFH035). Gli autori desiderano ringraziare Zhao Wang e Yanqiu Gao del Laboratorio di Chirurgia Pediatrica per l’allevamento di pesci zebra legati a questo lavoro. Gli autori desiderano inoltre ringraziare tutti i revisori che hanno partecipato alla revisione, nonché MJEditor (www.mjeditor.com) per aver fornito servizi di revisione in inglese durante la preparazione di questo manoscritto.
Materials
| Kinger's cell dissociation solution | PlantChemMed | PC-33689 | Kinger's cell dissociation solution can be stored stably at -20 °C after packaging and can be used after thawing at low temperature (4 °C). It can be used directly for dissociating zebrafish ovaries. The optimal temperature is 28.5 °C, for approximately 2-3 hours. The duration can be adjusted according to the specific dissociation conditions, either shortened or extended (https://www.plantchemmed.com/chanpin?productNo=PC-33689). |
| Cell strainers (100 μm ) | Falcon | 352360 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
| Forceps | Dumont | #5 | |
| Glass capillary needle | / | / | Blunted by burning with lighter |
| Hoechst | Yesen | 40732ES03 | |
| Low adsorption pipette tips (10 μl ) | Labsellect | T-0010-LR-R-S | |
| Leibovitz’s L-15 medium medium (with L-glutamine) | Hyclone | SH30525.01 | |
| Ice bucket | / | / | Ice-cold water is used to euthanize zebrafish |
| Incubator | WIGGENS | WH-01 | |
| Juvenile fish | / | / | 5–6 weeks post-fertilization, standard length [SL] of 10–15 mm |
| Plastic dish (35 mm ) | SORFA | 230101 | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-161 | |
| Tissue Culture Plate (6-wells) | SORFA | 0110006 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Toosl | #15000-00 |
References
- Qin, J. Y., et al. Unraveling the mechanism of long-term bisphenol S exposure disrupted ovarian lipids metabolism, oocytes maturation, and offspring development of zebrafish. Chemosphere. 277, 130304 (2021).
- Hau, H. T. A., et al. Maternal Larp6 controls oocyte development, chorion formation and elevation. Development. 147 (4), 187385 (2020).
- Cabrera-Quio, L. E., Schleiffer, A., Mechtler, K., Pauli, A. Zebrafish ski7 tunes RNA levels during the oocyte-to-embryo transition. PLoS Genet. 17 (2), e1009390 (2021).
- Liu, Y., et al. Single-cell transcriptome reveals insights into the development and function of the zebrafish ovary. Elife. 11, 76014 (2022).
- Li, C. W., Ge, W. Spatiotemporal expression of bone morphogenetic protein family ligands and receptors in the zebrafish ovary: A potential paracrine-signaling mechanism for oocyte-follicle cell communication. Biol Reprod. 85 (5), 977-986 (2011).
- Zampolla, T., Spikings, E., Rawson, D., Zhang, T. Cytoskeleton proteins F-actin and tubulin distribution and interaction with mitochondria in the granulosa cells surrounding stage III zebrafish (Danio rerio) oocytes. Theriogenology. 76 (6), 1110-1119 (2011).
- Lubzens, E., Young, G., Bobe, J., Cerda, J. Oogenesis in teleosts: How eggs are formed. Gen Comp Endocrinol. 165 (3), 367-389 (2010).
- Song, Y., Hu, W., Ge, W. Establishment of transgenic zebrafish (Danio rerio) models expressing fluorescence proteins in the oocytes and somatic supporting cells. Gen Comp Endocrinol. 314, 113907 (2021).
- Sousa, M. L., et al. Reproductive hormones affect follicular cells and ooplasm of stage I and II oocytes in zebrafish. Reprod Fertil Dev. 28 (12), 1945-1952 (2016).
- Yan, Y. L., et al. Gonadal soma controls ovarian follicle proliferation through Gsdf in zebrafish. Dev Dyn. 246 (11), 925-945 (2017).
- Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio. J Morphol. 218 (2), 203-224 (1993).
- Wallace, R. A., Selman, K. Ultrastructural aspects of oogenesis and oocyte growth in fish and amphibians. J Electron Microsc Tech. 16 (3), 175-201 (1990).
- Elkouby, Y. M., Mullins, M. C. Methods for the analysis of early oogenesis in zebrafish. Dev Biol. 430 (2), 310-324 (2017).
- Ai, N., Liu, L., Lau, E. S., Tse, A. C., Ge, W. Separation of oocyte and follicle layer for gene expression analysis in zebrafish. Methods Mol Biol. 2218, 1-9 (2021).
- Zhan, C., et al. Explorations of the optimal method for isolating oocytes from zebrafish (Danio rerio) ovary. J Exp Zool B Mol Dev Evol. 330 (8), 417-426 (2018).
- Avma guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. Avma Available from: https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals (2020)
- Phs policy on humane care and use of laboratory animals. Olaw Available from: https://olaw.nih.gov/policies-laws/phs-policy.htm#Introduction (2015)
- Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR J. 53 (2), 192-204 (2012).
