Isolement rapide d’ovocytes de stade I chez un poisson-zèbre dépourvu de cellules de granulosa

Le poisson-zèbre est l’un des systèmes modèles les plus importants en biologie du développement. Au cours des dernières années, de nombreuses études ont utilisé le poisson-zèbre comme modèle pour étudier des événements biologiques importants et des processus régulateurs de l’ovocyte à l’embryon. Ceux-ci englobent les processus complexes du développement et de la maturation des ovocytes¹, la fonctionnalité des gènes maternels², la régulation des transitions mères-zygotiques³ et des analyses omiques approfondies⁴.

Les cellules de la granulosa, les cellules somatiques qui enveloppent et nourrissent l’ovocyte en développement dans le follicule ovarien ^5,6, jouent un rôle central dans ce processus de développement. Au fur et à mesure que les cellules germinales primordiales (PGC) évoluent en oogonies, elles sont entourées d’une monocouche de cellules de la granulosa⁷. Avec les cellules thécales externes, l’ovocyte et les cellules de la granulosa qui l’entourent constituent un follicule mature⁸. Compte tenu de la distinction fondamentale entre les cellules germinales et les cellules somatiques, l’obtention d’un échantillon d’ovocytes purs est impérative, en particulier pour les analyses liées au génome.

Au sein de la structure folliculaire du poisson-zèbre, les cellules de la granulosa présentent généralement un diamètre de seulement quelques microns⁸, ce qui souligne l’interconnexion intime entre les cellules de la granulosa et les ovocytes⁹. Cette association étroite présente un défi pour obtenir une séparation complète en raison de la différence considérable entre le nombre et le volume des cellules de la granulosa et ceux des ovocytes (des centaines de cellules de la granulosa par rapport à un seul ovocyte)^10,11. Même une contamination minime avec une seule cellule de granulosa peut entraver les analyses en aval ciblant spécifiquement les ovocytes. Par conséquent, pour les études axées sur les caractéristiques génomiques et épigénétiques, l’élimination des cellules de la granulosa est essentielle.

Bénéficiant de critères morphologiques bien caractérisés, les ovocytes à chaque stade peuvent être distingués sur la base du diamètre¹¹. Le processus d’ovogenèse chez le poisson-zèbre est classé en cinq étapes selon la morphologie et le caryotype¹¹. Les ovocytes de stade I (7-140 μm de diamètre) englobent les ovocytes du début de la méiose au stade précoce de la méiose I. Surtout, ces ovocytes sont transparents, ce qui permet d’observer le noyau central à travers la lumière transmise (Figure 1Ai). Les ovocytes de stade II (140-340 μm de diamètre) deviennent progressivement mousseux et translucides. Avec l’élargissement des follicules et la prolifération des alvéoles corticales, les vésicules germinales au centre deviennent difficiles à distinguer¹² (Figure 1Aii). Les ovocytes de stade III (340-690 μm de diamètre) accumulent progressivement de la vitellogénine et les follicules frais deviennent de plus en plus opaques (Figure 1Aiii). La méiose se poursuit dans les ovocytes de stade IV (690-730 μm de diamètre) lorsque les chromosomes entrent au milieu de la méiose II, où ils stagnent (Figure 1Aiv). Les ovocytes de stade V (730-750 μm de diamètre) sont arrivés à maturité et sont prêts pour l’ovulation ^7,11 (Figure 1Av).

Sur la base des caractéristiques uniques de chacun des stades susmentionnés, une méthode a été proposée pour isoler les ovocytes des stades I à III en digérant les ovaires du poisson-zèbre à l’aide d’une solution digestive contenant de la collagénase I, de la collagénase II et de l’hyaluronidase, suivie d’une filtration à travers une passoire cellulaire de taille spécifique¹³. Cependant, bien que cette méthode permette d’obtenir des ovocytes à différents stades de développement, elle ne parvient pas à séparer complètement les ovocytes et les cellules de la granulosa. D’autres chercheurs ont également suggéré des méthodes pour séparer les cellules de la granulosa des ovocytes. Cependant, ces méthodes reposent principalement sur des approches mécaniques, qui peuvent causer des lésions aux ovocytes, prennent du temps et sont insuffisantes pour obtenir un nombre important d’ovocytes à analyser^14,15.

Compte tenu des limites des méthodes existantes et des exigences spécifiques de la recherche, cette étude vise à établir une procédure permettant de séparer complètement les ovocytes et les cellules de la granulosa et d’obtenir un nombre suffisant d’ovocytes propres de stade I pour l’analyse. En développant la méthode^{référencée 13}, nous utilisons un tampon de digestion amélioré (voir le tableau des matériaux) qui est plus doux et facilite la dispersion des ovocytes et la dissociation des cellules de la granulosa. Ensuite, les ovocytes sont passés à travers une passoire cellulaire, suivi d’un lavage et d’une sélection microscopique supplémentaire, permettant l’acquisition d’un grand nombre d’ovocytes propres de stade I.