בידוד מהיר של ביציות שלב I בדגי זברה נטולי תאי גרנולוזה
Summary
פרוטוקול זה מתאר הליך שונה לבידוד מהיר של ביציות נקיות בשלב I בדגי זברה נטולות תאי גרנולוסה, ובכך מספק שיטה נוחה למחקר ספציפי לביציות.
Abstract
לחקר התפתחות הביציות השלכות משמעותיות בביולוגיה התפתחותית. דג הזברה (Danio rerio) נמצא בשימוש נרחב כאורגניזם מודל לחקר תהליכים התפתחותיים מוקדמים מביצית לעובר. בדגי זברה, הביציות מוקפות בשכבה אחת של תאי גרנולוזה סומטיים. עם זאת, הפרדת תאי גרנולוזה מביציות מציבה אתגר, שכן השגת ביציות טהורות חיונית לניתוח מדויק. למרות שהוצעו שיטות שונות לבידוד ביציות דגי זברה בשלבים התפתחותיים שונים, הטכניקות הנוכחיות אינן מצליחות להסיר תאי גרנולוזה לחלוטין, ומגבילות את הדיוק של ניתוח גנום המתמקד בביציות בלבד. במחקר זה פיתחנו בהצלחה תהליך מהיר ויעיל לבידוד ביציות טהורות בשלב I בדגי זברה תוך סילוק זיהום תאי גרנולוזה. טכניקה זו מאפשרת אנליזה ביוכימית ומולקולרית, במיוחד בחקר היבטים אפיגנטיים ומבנה גנומי ספציפיים לביציות. יש לציין כי השיטה ידידותית למשתמש, ממזערת את נזקי הביציות ומספקת פתרון מעשי למחקר וניתוח בהמשך.
Introduction
דג הזברה הוא בין מערכות המודל החשובות ביותר בביולוגיה התפתחותית. בשנים האחרונות, מחקרים רבים השתמשו בדגי הזברה כמודל לחקר אירועים ביולוגיים חשובים ותהליכי בקרה מביצית לעובר. אלה כוללים את התהליכים המורכבים של התפתחות והבשלת ביציות1, הפונקציונליות של גנים אימהיים2, ויסות מעברים אימהיים-זיגוטיים3, וניתוחי אומיקס נרחבים4.
תאי גרנולוסה, התאים הסומטיים העוטפים ומזינים את הביצית המתפתחת בתוך זקיק השחלה 5,6, ממלאים תפקיד מרכזי בתהליך התפתחותי זה. כאשר תאי נבט קדמוניים (PGC) מתפתחים לאוגוניה, הם מוקפים בשכבה אחת של תאי גרנולוזה7. יחד עם תאי התא החיצוניים, הביצית ותאי הגרנולוזה הסובבים אותה מהווים זקיק בוגר8. בהתחשב בהבחנה הבסיסית בין תאי נבט לתאים סומטיים, השגת דגימת ביצית טהורה היא הכרחית, במיוחד עבור ניתוחים הקשורים לגנום.
בתוך המבנה הפוליקולרי של דגי זברה, תאי גרנולוזה מציגים בדרך כלל קוטר של מיקרון בודד8, מה שמדגיש את הקשר האינטימי בין תאי גרנולוזה לביציות9. קשר הדוק זה מציב אתגר בהשגת הפרדה מלאה בשל ההבדל הניכר הן במספר תאי גרנולוזה והן בנפחם לעומת הביציות (מאות תאי גרנולוזה לעומת ביצית בודדת)10,11. אפילו זיהום מינימלי עם תא גרנולוזה יחיד יכול לעכב ניתוחים במורד הזרם המתמקדים במיוחד בביציות. לכן, עבור מחקרים המתמקדים במאפיינים גנומיים ואפיגנטיים, חיסול תאי גרנולוזה הוא חיוני.
בעזרת קריטריונים מורפולוגיים מאופיינים היטב, ניתן להבחין בין ביציות בכל שלב על פי קוטר11. תהליך האוגנזה בדגי זברה מסווג לחמישה שלבים על פי מורפולוגיה וקריוטיפ11. ביציות שלב I (בקוטר 7-140 מיקרומטר) מקיפות ביציות מתחילת המיוזה ועד לשלב המוקדם של המיוזה I. באופן מכריע, הביציות האלה שקופות, ומאפשרות תצפית על הגרעין המרכזי באמצעות אור מועבר (איור 1Ai). ביציות שלב II (קוטר 140-340 מיקרומטר) הופכות בהדרגה מוקצפות ושקופות. עם הגדלת הזקיקים והתפשטות הנאדיות בקליפת המוח, קשה להבחין בין שלפוחיות הנבט במרכז12 (איור 1Aii). ביציות שלב III (קוטר 340-690 מיקרומטר) צוברות בהדרגה ויטלוגנין, וזקיקים טריים נעשים אטומים יותר ויותר (איור 1Aiii). מיוזה ממשיכה בשלב IV של הביציות (קוטר 690-730 מיקרומטר) כאשר הכרומוזומים נכנסים לאמצע המיוזה II, שם הם קופאים (איור 1Aiv). ביציות שלב V (קוטר 730-750 מיקרומטר) הבשילו והן מוכנות לביוץ 7,11 (איור 1Av).
בהתבסס על המאפיינים הייחודיים של כל אחד מהשלבים הנ”ל, הוצעה שיטה לבודד ביציות משלבים I עד III על ידי עיכול שחלות דגי זברה באמצעות תמיסת עיכול המכילה collagenase I, collagenase II והיאלורונידאז, ולאחר מכן סינון באמצעות מסננת תאים בגודל ספציפי13. עם זאת, בעוד שיטה זו מאפשרת קבלת ביציות בשלבים התפתחותיים שונים, היא אינה מצליחה להפריד לחלוטין ביציות ותאי גרנולוזה. חוקרים אחרים הציעו גם שיטות להפרדת תאי גרנולוזה מביציות. עם זאת, שיטות אלה מסתמכות בעיקר על גישות מכניות, אשר יכולות לגרום נזק לביציות, הן גוזלות זמן, ואינן מספיקות להשגת מספר משמעותי של ביציות לניתוח14,15.
בהתחשב במגבלות השיטות הקיימות ודרישות המחקר הספציפיות, מחקר זה שואף לבסס הליך להפרדה יסודית של ביציות ותאי גרנולוזה ולהשיג מספר מספיק של ביציות נקיות בשלב I לניתוח. בהמשך לשיטה13, אנו משתמשים בחיץ עיכול משופר (ראו טבלת חומרים) שהוא עדין יותר ומקל על פיזור הביציות ודיסוציאציה של תאי גרנולוזה. לאחר מכן, הביציות מועברות דרך מסננת תאים, ולאחר מכן שטיפה וברירה מיקרוסקופית נוספת, המאפשרת רכישת מספר רב של ביציות נקיות בשלב I.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקר זה פיתחנו שיטה לבידוד ביציות טהורות ונקיות בשלב I, למעט תאי גרנולוסה, לצורך אנליזה במורד הזרם (במיוחד אנליזות גנומיות). בהשוואה בין שיטה שונה זו לשיטה13 הנזכרת, הביציות בשלב I המתקבלות בשיטה זו שלמות מורפולוגית, מספיקות במספרן וללא זיהום עם תאים סומטיים ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32170813 ו- 31871449) ומחלקת המדע והטכנולוגיה של סצ’ואן (2024NSFSC0651), ופרויקט 1.3·5 לדיסציפלינות של מצוינות – קרן מחקר קליני, בית החולים מערב סין, אוניברסיטת סצ’ואן (2024HXFH035). המחברים רוצים להודות לג’או וואנג וליאנצ’יו גאו מהמעבדה לכירורגיית ילדים על גידול דגי זברה הקשורים לעבודה זו. המחברים מבקשים להודות גם לכל הסוקרים שהשתתפו בסקירה, כמו גם ל-MJEditor (www.mjeditor.com) על מתן שירותי עריכה באנגלית במהלך הכנת כתב היד.
Materials
| Kinger's cell dissociation solution | PlantChemMed | PC-33689 | Kinger's cell dissociation solution can be stored stably at -20 °C after packaging and can be used after thawing at low temperature (4 °C). It can be used directly for dissociating zebrafish ovaries. The optimal temperature is 28.5 °C, for approximately 2-3 hours. The duration can be adjusted according to the specific dissociation conditions, either shortened or extended (https://www.plantchemmed.com/chanpin?productNo=PC-33689). |
| Cell strainers (100 μm ) | Falcon | 352360 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
| Forceps | Dumont | #5 | |
| Glass capillary needle | / | / | Blunted by burning with lighter |
| Hoechst | Yesen | 40732ES03 | |
| Low adsorption pipette tips (10 μl ) | Labsellect | T-0010-LR-R-S | |
| Leibovitz’s L-15 medium medium (with L-glutamine) | Hyclone | SH30525.01 | |
| Ice bucket | / | / | Ice-cold water is used to euthanize zebrafish |
| Incubator | WIGGENS | WH-01 | |
| Juvenile fish | / | / | 5–6 weeks post-fertilization, standard length [SL] of 10–15 mm |
| Plastic dish (35 mm ) | SORFA | 230101 | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-161 | |
| Tissue Culture Plate (6-wells) | SORFA | 0110006 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Toosl | #15000-00 |
References
- Qin, J. Y., et al. Unraveling the mechanism of long-term bisphenol S exposure disrupted ovarian lipids metabolism, oocytes maturation, and offspring development of zebrafish. Chemosphere. 277, 130304 (2021).
- Hau, H. T. A., et al. Maternal Larp6 controls oocyte development, chorion formation and elevation. Development. 147 (4), 187385 (2020).
- Cabrera-Quio, L. E., Schleiffer, A., Mechtler, K., Pauli, A. Zebrafish ski7 tunes RNA levels during the oocyte-to-embryo transition. PLoS Genet. 17 (2), e1009390 (2021).
- Liu, Y., et al. Single-cell transcriptome reveals insights into the development and function of the zebrafish ovary. Elife. 11, 76014 (2022).
- Li, C. W., Ge, W. Spatiotemporal expression of bone morphogenetic protein family ligands and receptors in the zebrafish ovary: A potential paracrine-signaling mechanism for oocyte-follicle cell communication. Biol Reprod. 85 (5), 977-986 (2011).
- Zampolla, T., Spikings, E., Rawson, D., Zhang, T. Cytoskeleton proteins F-actin and tubulin distribution and interaction with mitochondria in the granulosa cells surrounding stage III zebrafish (Danio rerio) oocytes. Theriogenology. 76 (6), 1110-1119 (2011).
- Lubzens, E., Young, G., Bobe, J., Cerda, J. Oogenesis in teleosts: How eggs are formed. Gen Comp Endocrinol. 165 (3), 367-389 (2010).
- Song, Y., Hu, W., Ge, W. Establishment of transgenic zebrafish (Danio rerio) models expressing fluorescence proteins in the oocytes and somatic supporting cells. Gen Comp Endocrinol. 314, 113907 (2021).
- Sousa, M. L., et al. Reproductive hormones affect follicular cells and ooplasm of stage I and II oocytes in zebrafish. Reprod Fertil Dev. 28 (12), 1945-1952 (2016).
- Yan, Y. L., et al. Gonadal soma controls ovarian follicle proliferation through Gsdf in zebrafish. Dev Dyn. 246 (11), 925-945 (2017).
- Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio. J Morphol. 218 (2), 203-224 (1993).
- Wallace, R. A., Selman, K. Ultrastructural aspects of oogenesis and oocyte growth in fish and amphibians. J Electron Microsc Tech. 16 (3), 175-201 (1990).
- Elkouby, Y. M., Mullins, M. C. Methods for the analysis of early oogenesis in zebrafish. Dev Biol. 430 (2), 310-324 (2017).
- Ai, N., Liu, L., Lau, E. S., Tse, A. C., Ge, W. Separation of oocyte and follicle layer for gene expression analysis in zebrafish. Methods Mol Biol. 2218, 1-9 (2021).
- Zhan, C., et al. Explorations of the optimal method for isolating oocytes from zebrafish (Danio rerio) ovary. J Exp Zool B Mol Dev Evol. 330 (8), 417-426 (2018).
- Avma guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. Avma Available from: https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals (2020)
- Phs policy on humane care and use of laboratory animals. Olaw Available from: https://olaw.nih.gov/policies-laws/phs-policy.htm#Introduction (2015)
- Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR J. 53 (2), 192-204 (2012).
