فحص للكشف عن حماية الأوعية الدموية في شبكية العين من الموت المرتبط بمرض السكري في الفئران
Summary
تم تطوير مقايسة حماية لمراقبة مرونة الأوعية الدموية في شبكية العين حتى الموت من الإهانات المرتبطة بمرض السكري / اعتلال الشبكية السكري مثل الإجهاد التأكسدي والسيتوكينات.
Abstract
اعتلال الشبكية السكري (DR) هو مرض عيني معقد وتدريجي يتميز بمرحلتين متميزتين في التسبب فيه. تتضمن المرحلة الأولى فقدان الحماية من الأضرار التي يسببها مرض السكري في شبكية العين ، بينما تركز المرحلة الثانية على تراكم هذا الضرر. تركز المقايسات التقليدية في المقام الأول على تقييم التنكس الشعري ، وهو ما يدل على شدة الضرر ، ويعالج بشكل أساسي المرحلة الثانية من DR. ومع ذلك ، فإنها توفر فقط بشكل غير مباشر نظرة ثاقبة حول ما إذا كانت آليات الحماية للأوعية الدموية في شبكية العين قد تعرضت للخطر. لمعالجة هذا القيد ، تم تطوير نهج جديد لتقييم آليات حماية شبكية العين بشكل مباشر – على وجه التحديد ، مرونتها ضد الإهانات التي يسببها مرض السكري مثل الإجهاد التأكسدي والسيتوكينات. على الرغم من أن اختبار الحماية هذا مصمم في البداية لاعتلال الشبكية السكري ، إلا أنه يحمل إمكانية تطبيقات أوسع في كل من السياقات الفسيولوجية والمرضية. باختصار ، ينطوي فهم التسبب في اعتلال الشبكية السكري على التعرف على المراحل المزدوجة لفقدان الحماية وتراكم الضرر ، مع اختبار الحماية المبتكر هذا الذي يوفر أداة قيمة للبحث وربما يمتد إلى حالات طبية أخرى.
Introduction
اعتلال الشبكية السكري (DR) هو أحد مضاعفات الأوعية الدموية الدقيقة لمرض السكري (DM) ، والسبب الرئيسي للعمى لدى الأفراد في سن العمل في البلدان المتقدمة1. عوامل الخطر الرئيسية لاعتلال الشبكية السكري هي مدة ودرجة ارتفاع السكر في الدم2،3،4. في حين أن DM يسبب خللا في كل من المكونات الوعائية والعصبية للشبكية5 ، فإن تشخيص DR يعتمد على السمات المورفولوجية للأوعية الدموية في شبكيةالعين 6.
الإجهاد التأكسدي الناجم عن ارتفاع السكر في الدم هو أحد محركات التسبب في DR7. يؤدي الإجهاد التأكسدي المتزايد إلى تلف واسع النطاق ، مما يضر بوظائف الميتوكوندريا وبالتالي يزيد من مستوى أنواع الأكسجين التفاعلية. ويرافق هذه الأحداث تسرب الأوعية الشبكية ، وزيادة في مستوى السيتوكينات الالتهابية ، وموت كل من أنواع الخلايا العصبية والأوعية الدموية داخل شبكية العين. يؤدي فقدان الخلايا الوعائية ، وبالتالي وظائف الشبكة الشعرية الواسعة للشبكية ، إلى نقص الأكسجة ، وهو حافز قوي لمجموعة متنوعة منالاستجابات 5. وتشمل هذه الاستجابات زيادة التعبير عن عامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF) الذي يدفع كلا من النفاذية وتكوين الأوعية الدموية ، والسمات الأساسية للمراحل المتقدمة التي تهدد البصر من DR – الوذمة البقعية السكرية ، واعتلال الشبكية السكريالتكاثري 6.
تشير بعض ميزات DR إلى أن الكائن الحي (كل من المرضى التجارب) لديه قدرة جوهرية على مقاومة هذا المؤشر. يعاني المرضى من عدة عقود من DM قبل أن يصابوا ب DR8،9،10،11،12،13 التي تهدد البصر. في حين أن نماذج القوارض من DM لا تطور المراحل المتقدمة التي تهدد البصر من DR14 ، فإن الشكل الأولي / المعتدل من DR الذي يظهر لا يفعل ذلك إلا بعد فترة أسابيع أو أشهر من DM15،16. علاوة على ذلك ، في كل من المرضى التجارب ، يكون DR تقدميا ، ويزداد ضعف / تلف الشبكية مع إطالة مدة DM. أخيرا ، بعض المرضى الذين يعانون من DM لا يصابون أبدا ب DR. في بعض الحالات ، هذا لأن هؤلاء الأفراد لا يعانون من مرض السكري لفترة كافية لتطوير DR. في حالات أخرى ، يكون ذلك لأنهم يظهرون مقاومة غير عادية ل DR. كما هو الحال مع المشاركين في دراسة الميدالية ، الذين لا يصابون ب DR بعد 50 عاما أو أكثر منDM 17. وعلى الرغم من هذا الدعم المقنع لوجود الحماية من DR وأهميتها الانتقالية الهائلة، لم يتم التحقيق بقوة في الآلية الكامنة وراء الحماية.
تم تطوير مقايسة الحماية الموصوفة هنا لتسهيل التحقيق في سبب تأخر DR من بداية DM في الفئران المصابة بالسكري. تشمل الخطوات الرئيسية لهذا الفحص ، المطبقة على الفئران DM وغير DM ، (1) تقديم إهانة دون الحد الأقصى للموت للعين (خارج الجسم الحي أو في الجسم الحي) ، (2) عزل الأوعية الدموية في شبكية العين ، (3) تلطيخ الأوعية الدموية باستخدام TUNEL و DAPI ، (4) تصوير الصور الناتجة وتحديد النسبة المئوية لأنواع TUNEL / DAPI المزدوجة الإيجابية.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة ، تم إنشاء اختبار للكشف عن مقاومة / ضعف الأوعية الدموية في شبكية العين حتى الموت الناجم عن الإهانات المتعلقة ب DM / DR مثل نقص التروية / الإجهاد التأكسدي والسيتوكينات. تقدم هذه المخطوطة وصفا تفصيليا لهذا الفحص ، وهو تعديل للعديد من البروتوكولات المنشورة19،20،21.
ويشمل البروتوكول عدة مراحل حاسمة. أولا ، من الضروري تشريح شبكية العين بدقة ، وضمان الحفاظ على شبكة الأوعية الدموية ومنع التمزقات الكبيرة. يمكن تحقيق ذلك عن طريق إجراء شق 2-3 مم خلف النسيان لأن الشبكية تلتصق بإحكام بأورا سيراتا ، وفصلها يمثل تحديا. ثانيا ، قم بتغطية جميع الأدوات التي تتلامس مع الأوعية (على سبيل المثال ، فرش الشعر الفردي ، ونقل الماصة ، والملقط) بالتربسين عن طريق غمس هذه الأدوات في محلول YL trypsin طوال الإجراء. هذا يمنع الأوعية الدموية من الالتصاق بالأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول. ثالثا ، نظرا لأن الأوعية الدموية الدقيقة غير مرئية تقريبا تحت الضوء العادي ، فإن اليقظة العالية مطلوبة أثناء شفط الحطام ونقله إلى شريحة المجهر من أجل منع الفقد العرضي.
درجة مناسبة من الهضم الأنزيمي للطبقات المختلفة من شبكية العين أمر بالغ الأهمية. يمنع الهضم غير الكافي فصل الأنسجة العصبية عن شبكة الأوعية الدموية ، بينما يذوب الهضم المفرط الضفيرة الوعائية. تم الإبلاغ عن أوقات هضم مختلفة تتراوح من 1 ساعة و19 إلى 23 بين عشية وضحاها. بناء على الملاحظات ، فإن وقت الهضم البالغ 4 ساعات و 15 دقيقة ينتج عنه أفضل النتائج مقارنة بفترات 2 ساعة و 3 ساعات و 4 ساعات. من غير المرجح أن يؤدي إطالة عملية الهضم إلى ما بعد هذه النقطة إلى تعزيز العملية وقد يضر بدلا من ذلك بسلامة الأوعية الدموية.
في الحالات التي تلتصق فيها شبكية العين المهضومة بفرشاة الشعر الواحد ، اغمس الشعر في محلول YL trypsin عدة مرات. هذا يقلل من المناطق اللزجة للفرشاة. إذا كانت فرشاة الشعر لا تزال تلتصق بأنسجة الأوعية الدموية ، فقم بفحصها بحثا عن الأجزاء المتبقية من الجسم الزجاجي ، وقم بإزالتها بالملقط.
اللحظة المثلى لإزالة الجسم الزجاجي الكامل هي بعد القضاء على المستقبلات الضوئية ، ولكن قبل إزالة الأنسجة العصبية والدبقية المتبقية. تحافظ شبكية العين على الصلابة حتى تتم إزالة المستقبلات الضوئية. استخراج الجسم الزجاجي في هذه المرحلة يمكن أن يمزق الشبكية / الأوعية الدموية. تلعب الطبقات الحساسة من الأنسجة العصبية والدبقية المتبقية دورا محوريا في الحفاظ على الشكل المنحني لهيكل الأوعية الدموية. تمنع شبكية العين من التمزق في مركزها عندما يتم فصل الجسم الزجاجي عن العصب البصري.
إذا لم تلتصق الأوعية الدموية المعزولة بشريحة المجهر على الإطلاق ، فهذا يشير إلى أن قسم الشريحة الذي من المتوقع أن يحدث فيه الالتصاق متسخ. حاول تحريك الأوعية عبر سطح الشريحة لتحديد مكان لزج ، أو التبديل إلى شريحة مختلفة أو تنظيف الشريحة بدقة والمحاولة مرة أخرى. إذا التصقت الأوعية بالشريحة قبل أن تنفتح في شكلها الشبيه بالوعاء ، ارفع الأوعية الدموية من الشريحة للسماح لها بالطفو بحرية في الماء مرة أخرى. قم بهذه الخطوة باستخدام الملقط الذي تم غمسه بشكل متكرر في محلول YL trypsin.
تم الإبلاغ عن العديد من التقنيات البديلة لعزل الأوعية الدموية ، والتي لن تكون مناسبة لمقايسة الحماية الموصوفة هنا. على سبيل المثال ، تم استخدام التحلل التناضحي لعزل الأوعية الدموية من عينات شبكية العين غير الثابتة ، مما يسهل التحقيقات الكيميائية الحيوية للأنسجة24،25. ومع ذلك ، قد لا يحافظ هذا الإجراء على تشريح الأوعية الدموية وكذلك النهج المستخدم في هذه المقالة. وبالمثل ، في حين أن طريقة طباعة الأنسجة لعزل أجزاء كبيرة من الأوعية الدموية الدقيقة تمكن من تحليل البنية الكهروتونية للأوعيةالدموية 26 ، فإن السرير الوعائي بأكمله لا يتم استرداده عادة.
تم تطوير هذا الاختبار لأن الأساليب الحالية لرصد تنكس الشعيرات الدموية لا تعالج مسألة الحماية. يشير التنكس الشعري ، الذي يحدث بعد DM لفترة طويلة ، إلى ما إذا كان DR قد تطور. بالإضافة إلى تشخيص DR ، هذه النتيجة مفيدة لتقييم ما إذا كان العامل / العلاج يمنع DR. ومع ذلك ، فإن مقايسات تنكس الشعيرات الدموية الحالية لا تتحدث عن الآلية الأساسية لعمل العامل. مثل هذا العامل قد يمنع الأحداث المرضية التي تدفع DR مثل زيادة الإجهاد التأكسدي أو السيتوكينات. بدلا من ذلك ، قد يفرض العامل الحماية من خلال تعزيز المرونة في الإجهاد التأكسدي والسيتوكينات و / أو تعزيز إصلاح الضرر. يمكن استخدام اختبار الحماية الجديد هذا لتحديد ما إذا كان التأثير المفيد لعلاج معين ينطوي على فرض النظام الداخلي الذي يحمي من الموت المرتبط ب DM.
عيب مقايسة الحماية هذه هو أنها لا تميز بين نوعي الخلايا داخل الأوعية الشبكية: الخلايا البطانية (ECs) والخلايا المحيطة (PCs). في حين أن مظهر نواتها في أقسام ملطخة بالباش خاص بنوع الخلية (الشكل 6) ، لا تعرض كل نواة ميزات تشخيصية. لا يمكن تعريف ما يقرب من 30٪ من النوى بشكل لا لبس فيه على أنها EC أو PC جزئيا على الأقل لأن الصور ثنائية الأبعاد التي تم الحصول عليها من العينات الملطخة بالباش تحل بشكل غير كامل البنية ثلاثية الأبعاد للضفيرة الوعائية. يمكن التغلب على هذه العقبة من خلال تحليل إضافي مثل تلطيخ الفلورسنت المناعي بعلامات خاصة بنوع الخلية. مثل هذه الصور ، التي تميز بين نوعي الخلايا ، يمكن تلطيخها بالاشتراك مع TUNEL لتحديد مقاومة / ضعف كل نوع من أنواع الخلايا الوعائية.
لا يوفر هذا الفحص الذي يركز على الأوعية الدموية أي معلومات تتعلق بالشبكية العصبية. ويمكن وضع مقايسات إضافية لتوفير هذه المعلومات. على سبيل المثال ، بدلا من عزل الأوعية الدموية في شبكية العين ، يمكن إنشاء تعليق خلية واحدة لشبكية العين بأكملها ثم تحليلها (عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورسنت) للمقاومة / الضعف. إن إدراج علامات خاصة بنوع الخلية (العصبية والأوعية الدموية على حد سواء) جنبا إلى جنب مع مؤشرات موت الخلايا من شأنه أن يوفر صورة أكثر اكتمالا لأنواع خلايا الشبكية التي لديها القدرة على الحماية من الموت بوساطة DM / DR.
في الختام ، يوفر اختبار الحماية الموصوف هنا نهجا قويا للتحقيق في الآلية المسؤولة عن التأخير بين ظهور DM وظهور DR في الفئران.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل بمنح من جمعية إلينوي للوقاية من العمى والمعهد الوطني للصحة (EY031350 و EY001792) ومنحة غير مقيدة من مؤسسة أبحاث الوقاية من العمى.
Materials
| 10% neutral buffered formalin | Fischer Scientific | SF100-4 | Fixation |
| 24-well plates | Falcon | 353047 | |
| 33 G needle | Hamilton | customized | |
| Ammonium hydroxide | Sigma | 221228-1L-PCA | |
| C57/BL6/J mice | The Jackson Laboratory | Jax #000664 | |
| Cytokine cocktail | consisted of a 1:1:1 ratio of 1 µg/mL TNF-α, 1 µg/mL IL-1 β and and 1500 U/µLIFN- γ | ||
| Dissecting microscope | Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. | ||
| Dumont #3 forceps | Fine Science Tools (FST) | 11231-30 | Straight tips |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools (FST) | 11253-25 | Micro-blunted tips |
| Easy-Grip Tissue Culture Dishes | Falcon | 353001 | 35 x 10 mm |
| Glass transfer pipet | Fischer Scientific | 1367820A | snap off the thin end of a Pasteur pipet and fit the “broken” end with a rubber bulb. |
| Harris modified hematoxylin | Sigma | HHS32 | |
| Image J | NIH, Bethesda | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein | Milipore | 11684795910 | TUNEL reaction mixture |
| Micro cover glasses | VWR | 48366-227 | 22 mm x 22 mm |
| Microknife | Sharpoint | 72-1551 | |
| Micro-spatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Mounting cassette | Any transparent cassette that is slightly bigger than the microscope slide | ||
| Periodic acid | Sigma | 3951 | |
| Periodic acid solution | 35 mM periodic acid with 12 mM sodium acetate in H2O | ||
| Permount mounting medium | Fischer Scientific | SP15- 100 | |
| Prism 9 | GraphPad | ||
| Prolog Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| Recombinant human IFN- γ | Peprotec | 300-02 | |
| Recombinant human IL-1 β | Peprotec | 200-01B | |
| Recombinant human TNF-α | Peprotec | 300-01A | |
| Schiff reagent base | Sigma | 3952016 | |
| Shaker Incubator (belly button shaker) | IBI Scientific | BBUAAUV1S | |
| Sodium acetate | Sigma | 71196 | |
| Steritop sterile vacuum bottle | Millipore | SCGPS05RE | Create filtered water |
| Superfrost Plus treated microscope slides | Fischer Scientific | 12-550-15 | use slides from unopened box |
| Tert-butyl hydroperoxide (TBH) | Sigma | 75-91-2 | |
| TRIZMA base | Fischer Scientific | 11-101-5522 | make 100 mM Tris, adjust pH to 7.8 using HCl) |
| Trypsin 1:250 | Amresco | 0458-50G | |
| Two “brushes” | made from single black hair taped to the end of plastic transfer pipet. One brush with a free end. The other brush with a loop | ||
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools (FST) | 15000-00 | |
| Xylene | Sigma | 65351-M | |
| YL trypsin solution | 3% trypsin in 0.1 M Tris (pH 7.8) | ||
| Zeiss LSM 710 fluorescence microscope | Zeiss Microscopy |
References
- Teo, Z. L., et al. Global prevalence of diabetic retinopathy and projection of burden through 2045: Systematic review and meta-analysis. Ophthalmology. 128 (11), 1580-1591 (2021).
- Lee, R., Wong, T. Y., Sabanayagam, C. Epidemiology of diabetic retinopathy, diabetic macular edema and related vision loss. Eye Vis (Lond). 2, 21 (2015).
- Lima, V. C., Cavalieri, G. C., Lima, M. C., Nazario, N. O., Lima, G. C. Risk factors for diabetic retinopathy: A case-control study. Int J Retina Vitreous. 2, 21 (2016).
- Sabanayagam, C., Yip, W., Ting, D. S., Tan, G., Wong, T. Y. Ten emerging trends in the epidemiology of diabetic retinopathy. Ophthalmic Epidemiol. 23 (4), 209-222 (2016).
- Antonetti, D. A., Silva, P. S., Stitt, A. W. Current understanding of the molecular and cellular pathology of diabetic retinopathy. Nat Rev Endocrinol. 17 (4), 195-206 (2021).
- Wong, T., Cheung, C., Larsen, M., Sharma, S., Simó, R. Diabetic retinopathy. Nat Rev Dis Primers. 2, 16012 (2016).
- Wu, M. Y., Yiang, G. T., Lai, T. T., Li, C. J. The oxidative stress and mitochondrial dysfunction during the pathogenesis of diabetic retinopathy. Oxid Med Cell Longev. 2018, 3420187 (2018).
- Hietala, K., Harjutsalo, V., Forsblom, C., Summanen, P., Groop, P. H. Age at onset and the risk of proliferative retinopathy in type 1 diabetes. Diabetes Care. 33 (6), 1315-1319 (2010).
- Aiello, L. P., et al. Diabetic retinopathy. Diabetes Care. 21 (1), 143-156 (1998).
- Klein, R., Klein, B. E., Moss, S. E., Davis, M. D., Demets, D. L. The wisconsin epidemiologic study of diabetic retinopathy. Prevalence and risk of diabetic retinopathy when age at diagnosis is less than 30 years. Arch Ophthalmol. 102 (4), 520-526 (1984).
- Nathan, D. M., et al. The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus. N Engl J Med. 329 (14), 977-986 (1993).
- . Clustering of long-term complications in families with diabetes in the diabetes control and complications trial. The diabetes control and complications trial research group. Diabetes. 46 (11), 1829-1839 (1997).
- Cruickshanks, K. J., Moss, S. E., Klein, R., Klein, B. E. Physical activity and proliferative retinopathy in people diagnosed with diabetes before age 30 yr. Diabetes Care. 15 (10), 1267-1272 (1992).
- Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. S. Update on animal models of diabetic retinopathy: From molecular approaches to mice and higher mammals. Dis Model Mech. 5 (4), 444-456 (2012).
- Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. J Neurophysiol. 113 (4), 1085-1099 (2015).
- Sergeys, J., et al. Longitudinal in vivo characterization of the streptozotocin-induced diabetic mouse model: Focus on early inner retinal responses. Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (2), 807-822 (2019).
- Sun, J. K., et al. Protection from retinopathy and other complications in patients with type 1 diabetes of extreme duration: The joslin 50-year medalist study. Diabetes Care. 34 (4), 968-974 (2011).
- Li, Y., et al. The slow progression of diabetic retinopathy is associated with transient protection of retinal vessels from death. Int J Mol Sci. 24 (13), 10869 (2023).
- Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. Trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model. J Vis Exp. 76, e50489 (2013).
- Veenstra, A., et al. Diabetic retinopathy: Retina-specific methods for maintenance of diabetic rodents and evaluation of vascular histopathology and molecular abnormalities. Curr Protoc Mouse Biol. 5 (3), 247-270 (2015).
- Zheng, L., Gong, B., Hatala, D. A., Kern, T. S. Retinal ischemia and reperfusion causes capillary degeneration: Similarities to diabetes. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (1), 361-367 (2007).
- Mizutani, M., Kern, T. S., Lorenzi, M. Accelerated death of retinal microvascular cells in human and experimental diabetic retinopathy. J Clin Invest. 97 (12), 2883-2890 (1996).
- Weerasekera, L. Y., Balmer, L. A., Ram, R., Morahan, G. Characterization of retinal vascular and neural damage in a novel model of diabetic retinopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (6), 3721-3730 (2015).
- Dagher, Z., et al. Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy. Diabetes. 53 (9), 2404-2411 (2004).
- Podestà, F., et al. Bax is increased in the retina of diabetic subjects and is associated with pericyte apoptosis in vivo and in vitro. Am J Pathol. 156 (3), 1025-1032 (2000).
- Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: New experimental approach/new insights. Prog Retin Eye Res. 31 (3), 258-270 (2012).
