Een test om bescherming van het netvlies te detecteren tegen diabetesgerelateerde sterfte bij muizen
Summary
Er werd een beschermingstest ontwikkeld om de veerkracht van het netvlies tegen overlijden door diabetes/diabetische retinopathie-gerelateerde beledigingen zoals oxidatieve stress en cytokines te controleren.
Abstract
Diabetische retinopathie (DR) is een complexe en progressieve oogziekte die wordt gekenmerkt door twee verschillende fasen in de pathogenese ervan. De eerste fase omvat het verlies van bescherming tegen door diabetes veroorzaakte schade aan het netvlies, terwijl de tweede fase zich concentreert op de accumulatie van deze schade. Traditionele tests richten zich voornamelijk op het evalueren van capillaire degeneratie, wat een indicatie is van de ernst van de schade, en richten zich in wezen op de tweede fase van DR. Ze geven echter slechts indirect inzicht in de vraag of de beschermende mechanismen van het retinale vaatstelsel zijn aangetast. Om deze beperking aan te pakken, werd een nieuwe benadering ontwikkeld om de beschermende mechanismen van het netvlies direct te beoordelen – met name de veerkracht tegen door diabetes veroorzaakte beledigingen zoals oxidatieve stress en cytokines. Deze beschermingstest, hoewel oorspronkelijk ontworpen voor diabetische retinopathie, heeft het potentieel voor bredere toepassingen in zowel fysiologische als pathologische contexten. Samenvattend omvat het begrijpen van de pathogenese van diabetische retinopathie het herkennen van de dubbele fasen van beschermingsverlies en accumulatie van schade, waarbij deze innovatieve beschermingstest een waardevol hulpmiddel biedt voor onderzoek en mogelijk kan worden uitgebreid naar andere medische aandoeningen.
Introduction
Diabetische retinopathie (DR) is een van de microvasculaire complicaties van diabetes mellitus (DM) en de belangrijkste oorzaak van blindheid bij personen in de werkende leeftijd in ontwikkelde landen. Belangrijke risicofactoren voor diabetische retinopathie zijn de duur en mate van hyperglykemie 2,3,4. Terwijl DM disfunctie veroorzaakt van zowel de vasculaire als de neurale componenten van het netvlies5, is de diagnose van DR gebaseerd op morfologische kenmerken van het retinale vaatstelsel6.
Hyperglykemie-geïnduceerde oxidatieve stress is een van de aanjagers van DR-pathogenese7. Verhoogde oxidatieve stress veroorzaakt wijdverbreide schade, die de functionaliteit van de mitochondriën in gevaar brengt en daardoor het niveau van reactieve zuurstofsoorten verder verhoogt. Deze gebeurtenissen gaan gepaard met lekkage van netvliesvaten, een toename van het niveau van inflammatoire cytokines en de dood van zowel neurale als vasculaire celtypen in het netvlies. Verlies van vasculaire cellen, en dus de functionaliteit van het uitgebreide capillaire netwerk van het netvlies, resulteert in hypoxie, een krachtige stimulus voor een verscheidenheid aan reacties. Dergelijke reacties omvatten verhoogde expressie van vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) die zowel permeabiliteit als angiogenese stimuleert, kardinale kenmerken van de gevorderde, zichtbedreigende stadia van DR – diabetisch macula-oedeem, en proliferatieve diabetische retinopathie6.
Bepaalde kenmerken van DR suggereren dat een organisme (zowel patiënten als proefdieren) een intrinsiek vermogen heeft om deze indicatie te weerstaan. Patiënten ervaren tientallen jaren DM voordat ze gezichtsbedreigende DR 8,9,10,11,12,13 ontwikkelen. Hoewel knaagdiermodellen van DM niet de vergevorderde, gezichtsbedreigende stadia van DR14 ontwikkelen, doet de aanvankelijke/milde vorm van DR die zich manifesteert dit pas na een periode van weken of maanden van DM15,16. Bovendien is DR bij zowel patiënten als proefdieren progressief en neemt de disfunctie/schade aan het netvlies toe naarmate de duur van DM langer duurt. Ten slotte ontwikkelen sommige patiënten met DM nooit DR. In bepaalde gevallen komt dit omdat dergelijke personen diabetes niet lang genoeg ervaren om DR te ontwikkelen. In andere gevallen is het omdat ze buitengewone weerstand tegen DR vertonen; zoals het geval is met deelnemers aan de Medalist-studie, die na 50 of meer jaar DM17 geen DR ontwikkelen. Ondanks deze overtuigende steun voor het bestaan van bescherming tegen DR en de enorme translationele relevantie ervan, is het mechanisme dat ten grondslag ligt aan bescherming niet agressief onderzocht.
De hierin beschreven beschermingstest is ontwikkeld om te onderzoeken waarom DR wordt vertraagd vanaf het begin van DM bij diabetische muizen. De belangrijkste stappen van deze test, toegepast op DM- en niet-DM-muizen, omvatten (1) het toedienen van een submaximale doodsinducerende belediging aan het oog (ex vivo of in vivo), (2) het isoleren van de retinale vasculatuur, (3) het kleuren van de vasculatuur met TUNEL en DAPI, (4) het fotograferen van de resulterende beelden en het kwantificeren van het percentage TUNEL/DAPI dubbelpositieve soorten.
Protocol
Representative Results
Discussion
In deze studie werd een test opgesteld om resistentie/kwetsbaarheid van het retinale vaatstelsel voor de dood te detecteren die wordt veroorzaakt door DM/DR-gerelateerde beledigingen zoals ischemie/oxidatieve stress en cytokines. Dit manuscript geeft een gedetailleerde beschrijving van deze test, die een wijziging is van verschillende gepubliceerde protocollen 19,20,21.
Het protocol omvat een aantal cruciale fasen. Ten eerste is het absoluut noodzakelijk om het netvlies zorgvuldig te ontleden, het behoud van het vasculaire netwerk te waarborgen en substantiële scheuren te voorkomen. Dit kan worden bereikt door een incisie 2-3 mm achter de limbus te maken, aangezien het netvlies stevig hecht aan de ora serrata en het scheiden ervan een uitdaging is. Ten tweede, smeer alle instrumenten die in contact komen met de vaten (bijv. eenharige borstels, transferpipet en pincet) in met trypsine door deze gereedschappen tijdens de procedure in de YL-trypsineoplossing te dompelen. Dit voorkomt dat het vaatstelsel zich hecht aan de instrumenten die in dit protocol worden gebruikt. Ten derde, omdat de microvasculatuur bijna onzichtbaar is onder normaal licht, is verhoogde waakzaamheid vereist tijdens het opzuigen van puin en het overbrengen naar het microscoopglaasje om onbedoeld verlies te voorkomen.
Een passende mate van enzymatische vertering van de verschillende lagen van het netvlies is cruciaal; Onvoldoende spijsvertering verhindert de scheiding van neuronaal weefsel van het vasculaire netwerk, terwijl overmatige spijsvertering de vasculaire plexus oplost. Er zijn verschillende verteringstijden gemeld, variërend van 1 uur19 tot ‘s nachts 23 uur. Op basis van waarnemingen levert een verteringstijd van 4 uur en 15 minuten de meest gunstige resultaten op in vergelijking met een duur van 2 uur, 3 uur en 4 uur. Het is onwaarschijnlijk dat het verlengen van de spijsvertering na dit punt het proces zal verbeteren en in plaats daarvan de integriteit van het vaatstelsel in gevaar kan brengen.
In gevallen waarin het verteerde netvlies zich hecht aan de enkelharige borstel, dompel het haar dan meerdere keren in YL-trypsine-oplossing. Dit vermindert de plakkerige plekken van de borstel. Als de haarborstel nog steeds aan het vaatweefsel hecht, inspecteer deze dan op resterende glasvochtfragmenten en verwijder deze met een pincet.
Het optimale moment voor volledige glasvochtverwijdering is na het elimineren van de fotoreceptoren, maar voorafgaand aan het verwijderen van het resterende neurale en gliale weefsel. Het netvlies blijft stijf totdat fotoreceptoren worden verwijderd. Het extraheren van het glasvocht in dit stadium kan mogelijk het netvlies/vaatstelsel scheuren. De delicate lagen resterend neuraal en gliaweefsel spelen een cruciale rol bij het behoud van de gebogen vorm van de vasculaire structuur. Ze voorkomen dat het netvlies in het midden scheurt wanneer het glasvocht wordt losgemaakt van de oogzenuw.
Als het geïsoleerde vaatstelsel helemaal niet aan het microscoopglaasje hecht, geeft dit aan dat het gedeelte van het objectglaasje waar naar verwachting hechting zal optreden, vuil is. Probeer de vaten over het oppervlak van het glaasje te bewegen om een plakkerige plek te vinden, schakel over naar een ander glaasje of maak het glaasje zorgvuldig schoon en probeer het opnieuw. Als de vaten aan de glijbaan blijven plakken voordat ze zich in hun komachtige vorm ontvouwen, til dan het vaatstelsel van de glijbaan om het weer vrij in het water te laten drijven. Voer deze stap uit met een tang die herhaaldelijk in de YL-trypsine-oplossing is gedompeld.
Er zijn verschillende alternatieve technieken voor het isoleren van het vaatstelsel gerapporteerd, die niet geschikt zouden zijn voor de hierin beschreven beschermingstest. Osmotische lysis is bijvoorbeeld gebruikt om het vaatstelsel te isoleren van niet-gefixeerde netvliesmonsters, waardoor biochemisch onderzoek van het weefsel wordt vergemakkelijkt 24,25. Het is echter mogelijk dat deze procedure de anatomie van het vaatstelsel en de in dit artikel gebruikte benadering niet zo goed behoudt. Evenzo, hoewel de weefselafdrukmethode om grote segmenten van microvasculatuur te isoleren analyse van de elektrotonische architectuur van het vaatstelsel mogelijk maakt26, wordt het hele vaatbed doorgaans niet hersteld.
Deze test is ontwikkeld omdat de bestaande benaderingen voor het monitoren van capillaire degeneratie het probleem van bescherming niet aanpakken. Capillaire degeneratie, die optreedt na langdurige DM, geeft aan of DR zich heeft ontwikkeld. Naast het diagnosticeren van DR is deze uitkomst nuttig om te beoordelen of een middel/therapie DR voorkomt. Bestaande capillaire degeneratietesten spreken echter niet over het onderliggende werkingsmechanisme van het middel. Een dergelijk middel kan pathologische gebeurtenissen voorkomen die DR veroorzaken, zoals verhoogde oxidatieve stress of cytokines. Als alternatief kan het middel bescherming afdwingen door de veerkracht tegen oxidatieve stress en cytokines te vergroten en/of het herstel van schade te bevorderen. Deze nieuwe beschermingstest kan worden gebruikt om te bepalen of het gunstige effect van een bepaalde therapie bestaat uit het versterken van het endogene systeem dat beschermt tegen DM-gerelateerde sterfte.
Een nadeel van deze beschermingstest is dat er geen onderscheid wordt gemaakt tussen de twee celtypen in de netvliesvaten: endotheelcellen (EC’s) en pericyten (PC’s). Hoewel het uiterlijk van hun kernen in PASH-gekleurde secties specifiek is voor het celtype (Figuur 6), vertoont niet elke kern diagnostische kenmerken. Ongeveer 30% van de kernen kan niet eenduidig worden gedefinieerd als EC of PC, althans gedeeltelijk, omdat de tweedimensionale beelden die worden verkregen uit PASH-gekleurde monsters de driedimensionale structuur van de vasculaire plexus onvolledig oplossen. Dit obstakel kan worden overwonnen door aanvullende analyses, zoals immunofluorescerende kleuring met celtypespecifieke markers. Dergelijke beelden, die de twee celtypen onderscheiden, kunnen samen met TUNEL worden gekleurd om de weerstand/kwetsbaarheid van elk van de vasculaire celtypen te bepalen.
Deze vasculair gerichte test geeft geen informatie over het neurale netvlies. Er kunnen aanvullende tests worden ontwikkeld om dergelijke informatie te verstrekken. In plaats van het netvlies te isoleren, zou bijvoorbeeld een enkele celsuspensie van het hele netvlies kunnen worden gegenereerd en vervolgens kunnen worden geanalyseerd (door middel van fluorescerend geactiveerde celsortering) op weerstand/kwetsbaarheid. De opname van celtype-specifieke markers (zowel neuraal als vasculair) samen met indicatoren van celdood zou een completer beeld geven van de retinale celtypen die het vermogen hebben om te beschermen tegen DM/DR-gemedieerde dood.
Concluderend biedt de hierin beschreven beschermingstest een krachtige benadering voor het onderzoeken van het mechanisme dat verantwoordelijk is voor de vertraging tussen het begin van DM en de manifestatie van DR bij muizen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Illinois Society to Prevent Blindness, National Institute of Health (EY031350 and EY001792) en een onbeperkte subsidie van de Research to Prevent Blindness Foundation.
Materials
| 10% neutral buffered formalin | Fischer Scientific | SF100-4 | Fixation |
| 24-well plates | Falcon | 353047 | |
| 33 G needle | Hamilton | customized | |
| Ammonium hydroxide | Sigma | 221228-1L-PCA | |
| C57/BL6/J mice | The Jackson Laboratory | Jax #000664 | |
| Cytokine cocktail | consisted of a 1:1:1 ratio of 1 µg/mL TNF-α, 1 µg/mL IL-1 β and and 1500 U/µLIFN- γ | ||
| Dissecting microscope | Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. | ||
| Dumont #3 forceps | Fine Science Tools (FST) | 11231-30 | Straight tips |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools (FST) | 11253-25 | Micro-blunted tips |
| Easy-Grip Tissue Culture Dishes | Falcon | 353001 | 35 x 10 mm |
| Glass transfer pipet | Fischer Scientific | 1367820A | snap off the thin end of a Pasteur pipet and fit the “broken” end with a rubber bulb. |
| Harris modified hematoxylin | Sigma | HHS32 | |
| Image J | NIH, Bethesda | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein | Milipore | 11684795910 | TUNEL reaction mixture |
| Micro cover glasses | VWR | 48366-227 | 22 mm x 22 mm |
| Microknife | Sharpoint | 72-1551 | |
| Micro-spatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
| Mounting cassette | Any transparent cassette that is slightly bigger than the microscope slide | ||
| Periodic acid | Sigma | 3951 | |
| Periodic acid solution | 35 mM periodic acid with 12 mM sodium acetate in H2O | ||
| Permount mounting medium | Fischer Scientific | SP15- 100 | |
| Prism 9 | GraphPad | ||
| Prolog Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| Recombinant human IFN- γ | Peprotec | 300-02 | |
| Recombinant human IL-1 β | Peprotec | 200-01B | |
| Recombinant human TNF-α | Peprotec | 300-01A | |
| Schiff reagent base | Sigma | 3952016 | |
| Shaker Incubator (belly button shaker) | IBI Scientific | BBUAAUV1S | |
| Sodium acetate | Sigma | 71196 | |
| Steritop sterile vacuum bottle | Millipore | SCGPS05RE | Create filtered water |
| Superfrost Plus treated microscope slides | Fischer Scientific | 12-550-15 | use slides from unopened box |
| Tert-butyl hydroperoxide (TBH) | Sigma | 75-91-2 | |
| TRIZMA base | Fischer Scientific | 11-101-5522 | make 100 mM Tris, adjust pH to 7.8 using HCl) |
| Trypsin 1:250 | Amresco | 0458-50G | |
| Two “brushes” | made from single black hair taped to the end of plastic transfer pipet. One brush with a free end. The other brush with a loop | ||
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools (FST) | 15000-00 | |
| Xylene | Sigma | 65351-M | |
| YL trypsin solution | 3% trypsin in 0.1 M Tris (pH 7.8) | ||
| Zeiss LSM 710 fluorescence microscope | Zeiss Microscopy |
References
- Teo, Z. L., et al. Global prevalence of diabetic retinopathy and projection of burden through 2045: Systematic review and meta-analysis. Ophthalmology. 128 (11), 1580-1591 (2021).
- Lee, R., Wong, T. Y., Sabanayagam, C. Epidemiology of diabetic retinopathy, diabetic macular edema and related vision loss. Eye Vis (Lond). 2, 21 (2015).
- Lima, V. C., Cavalieri, G. C., Lima, M. C., Nazario, N. O., Lima, G. C. Risk factors for diabetic retinopathy: A case-control study. Int J Retina Vitreous. 2, 21 (2016).
- Sabanayagam, C., Yip, W., Ting, D. S., Tan, G., Wong, T. Y. Ten emerging trends in the epidemiology of diabetic retinopathy. Ophthalmic Epidemiol. 23 (4), 209-222 (2016).
- Antonetti, D. A., Silva, P. S., Stitt, A. W. Current understanding of the molecular and cellular pathology of diabetic retinopathy. Nat Rev Endocrinol. 17 (4), 195-206 (2021).
- Wong, T., Cheung, C., Larsen, M., Sharma, S., Simó, R. Diabetic retinopathy. Nat Rev Dis Primers. 2, 16012 (2016).
- Wu, M. Y., Yiang, G. T., Lai, T. T., Li, C. J. The oxidative stress and mitochondrial dysfunction during the pathogenesis of diabetic retinopathy. Oxid Med Cell Longev. 2018, 3420187 (2018).
- Hietala, K., Harjutsalo, V., Forsblom, C., Summanen, P., Groop, P. H. Age at onset and the risk of proliferative retinopathy in type 1 diabetes. Diabetes Care. 33 (6), 1315-1319 (2010).
- Aiello, L. P., et al. Diabetic retinopathy. Diabetes Care. 21 (1), 143-156 (1998).
- Klein, R., Klein, B. E., Moss, S. E., Davis, M. D., Demets, D. L. The wisconsin epidemiologic study of diabetic retinopathy. Prevalence and risk of diabetic retinopathy when age at diagnosis is less than 30 years. Arch Ophthalmol. 102 (4), 520-526 (1984).
- Nathan, D. M., et al. The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus. N Engl J Med. 329 (14), 977-986 (1993).
- . Clustering of long-term complications in families with diabetes in the diabetes control and complications trial. The diabetes control and complications trial research group. Diabetes. 46 (11), 1829-1839 (1997).
- Cruickshanks, K. J., Moss, S. E., Klein, R., Klein, B. E. Physical activity and proliferative retinopathy in people diagnosed with diabetes before age 30 yr. Diabetes Care. 15 (10), 1267-1272 (1992).
- Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. S. Update on animal models of diabetic retinopathy: From molecular approaches to mice and higher mammals. Dis Model Mech. 5 (4), 444-456 (2012).
- Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes. J Neurophysiol. 113 (4), 1085-1099 (2015).
- Sergeys, J., et al. Longitudinal in vivo characterization of the streptozotocin-induced diabetic mouse model: Focus on early inner retinal responses. Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (2), 807-822 (2019).
- Sun, J. K., et al. Protection from retinopathy and other complications in patients with type 1 diabetes of extreme duration: The joslin 50-year medalist study. Diabetes Care. 34 (4), 968-974 (2011).
- Li, Y., et al. The slow progression of diabetic retinopathy is associated with transient protection of retinal vessels from death. Int J Mol Sci. 24 (13), 10869 (2023).
- Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. Trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model. J Vis Exp. 76, e50489 (2013).
- Veenstra, A., et al. Diabetic retinopathy: Retina-specific methods for maintenance of diabetic rodents and evaluation of vascular histopathology and molecular abnormalities. Curr Protoc Mouse Biol. 5 (3), 247-270 (2015).
- Zheng, L., Gong, B., Hatala, D. A., Kern, T. S. Retinal ischemia and reperfusion causes capillary degeneration: Similarities to diabetes. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (1), 361-367 (2007).
- Mizutani, M., Kern, T. S., Lorenzi, M. Accelerated death of retinal microvascular cells in human and experimental diabetic retinopathy. J Clin Invest. 97 (12), 2883-2890 (1996).
- Weerasekera, L. Y., Balmer, L. A., Ram, R., Morahan, G. Characterization of retinal vascular and neural damage in a novel model of diabetic retinopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (6), 3721-3730 (2015).
- Dagher, Z., et al. Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy. Diabetes. 53 (9), 2404-2411 (2004).
- Podestà, F., et al. Bax is increased in the retina of diabetic subjects and is associated with pericyte apoptosis in vivo and in vitro. Am J Pathol. 156 (3), 1025-1032 (2000).
- Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: New experimental approach/new insights. Prog Retin Eye Res. 31 (3), 258-270 (2012).
